復方二至天癸顆粒對IVF準備周期子宮內膜Galectin-3的影響研究

張君探 連 方 趙 地

(1 棗莊市婦幼保健院生殖醫學中心，棗莊，277000； 2 山東中醫藥大學附屬醫院，濟南，250011； 3 山東中醫藥大學，濟南，250011)

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臨床研究

復方二至天癸顆粒對IVF準備周期子宮內膜Galectin-3的影響研究

張君探1連 方2趙 地3

(1 棗莊市婦幼保健院生殖醫學中心，棗莊，277000； 2 山東中醫藥大學附屬醫院，濟南，250011； 3 山東中醫藥大學，濟南，250011)

目的：觀察復方二至天癸顆粒對體外受精-胚胎移植(IVF-ET)準備周期子宮內膜半乳糖凝集素-3(Galectin-3)表達的影響，從而改善子宮內膜容受性，提高妊娠率的可能機制。方法：按隨機數字表法將進入體外受精-胚胎移植(IVF-ET)準備周期的不孕患者分為2組，治療組31例，對照組31例，分別予復方二至天癸顆粒、復方六味地黃顆粒預處理2個周期，并在第二周期月經第21天，吸取內膜組織少許，檢測Galectin-3；同時分別對2組患者腎氣陰兩虛證候積分變化、臨床妊娠率進行評定。結果：2組患者腎虛癥候均有改善，治療組改善更加明顯(P

Galectin-3；補腎；復方二至天癸顆粒；子宮內膜容受性；免疫

近年來，隨著體外受精—胚胎移植的發展，及其妊娠率的不斷提高，臨床上發現許多不孕患者，即使移植胚胎質量好的胚胎，仍不能懷孕。因此，胚胎著床也逐漸被人們所重視，近年來成為臨床研究的熱點，其中子宮內膜的接受性是胚胎著床過程中一個關健性因素。其中使用抑制性消減雜交技術[1]測序篩選出的半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是子宮內膜容受性相關基因。連方以“調經種子、補腎調周”之立法論治，擬定復方二至天癸顆粒，以補腎氣陰為主，輔以補腎陽暢氣血。本研究以子宮內膜中的Galectin-3為靶點切入研究，切入研究復方二至天癸顆粒治療IVF降調周期腎氣陰兩虛、改善子宮內膜Galectin-3失衡的治療優勢，提高臨床妊娠率，進一步解析胞宮為“藏而不泄”“腎主生殖”“腎主免疫”的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 臨床資料全部病例均選自2012年3月至2012年10月于山東中醫藥大學第一附屬醫院中西醫結合生殖與遺傳中心行IVF-ET治療并符合診斷標準的患者，同時均采用隨機雙盲數字表法對符合診斷標準的患者進行分組。2組患者的年齡及病程等一般資料之間的差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.1 診斷標準 現代醫學診斷標準：不孕癥診斷標準[2]：夫婦同居，性生活正常，同居2年未避孕未受孕者，其中從未有妊娠史者，稱原發不孕，有過妊娠史，稱為繼發不孕；中醫辨證標準：不孕癥腎氣陰兩虛證型辨證[3-4]：以下主癥必須具備，兼癥具備1～2項即可以診斷，主癥：腰膝酸軟；兼癥：1)五心煩熱，潮熱盜汗，或骨蒸發熱；2)神疲乏力；3)口燥咽干，形體消瘦，齒松發脫；4)陰中干澀；5)頭暈耳鳴甚至耳聾；6)性欲減退；7)失眠健忘；8)舌質紅、少津，少苔甚或無苔；9)尺脈細數沉弱。中醫癥狀積分標準[5]：參考中華人民共和國國家標準中醫臨床診療術語證候部分。

1.1.2 納入與排除標準 納入標準：1)符合本研究中醫腎氣陰兩虛辨證標準及現代醫學診斷標準；2)年齡在25～40歲；3)已婚婦女，夫婦雙方同意并自愿簽署知情同意書；4)男方行精液常規示大致正常。

排除標準：1)患有嚴重的身心疾病暫時不宜妊娠者；2)近期接觸有毒、有害及放射性物質不宜妊娠者；3)患有不宜生育的遺傳性疾病等患者；4)夫婦雙方不同意接受者。

1.1.3 IVF-ET周期前患者準備 首先了解患者基本情況，完善夫婦雙方常規身體情況體格及實驗室檢查等，及生殖相關輔助檢查等，選擇符合納入病例標準的患者，排除不符合標準的患者，建立詳細的患者檔案，并做必要的準備工作。夫婦雙方知情并愿意接受IVF-ET助孕治療，并簽署相關知情同意書，同時同意并自愿加入此次研究并簽署知情同意書，所有治療患者均采用雙盲法。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床分組 本研究對符合標準的患者采用雙盲隨機數字表的方法進行分組，治療組對照組各33例。在治療過程因個人原因中途放棄治療及卵巢反應差等原因而放棄周期的脫落病例共4例，對照組與治療組分別2例，統計最終病例數分別為治療組31例，對照組31例。

1.2.2 臨床藥物 復方二至天癸顆粒與復方六味地黃顆粒，規格均為：3 g/袋，12袋/盒，均由山東中醫藥大學附屬醫院制劑室提供，為連方經驗方。復方二至天癸顆粒由菟絲子、墨旱蓮、枸杞子、女貞子、制香附、川芎、熟地黃、白芍、當歸、炙甘草組成，批號：〔01〕FZ032-03。復方六味地黃顆粒，由澤瀉、牡丹皮、茯苓、山藥、山茱萸、熟地黃組成，批號：Z37020693。

1.2.3 研究步驟 治療組31例，在月經的第3天(IVF前2個周期)始給予復方二至天癸顆粒，3次/d，1袋/次，口服，服至注射絨毛膜促性腺激素(HCG)日停用。在預處理第二周期月經的第21天左右(即著床期)，并且本周期均不用避孕藥預處理，以取內膜管(由Wallace公司生產，型號為REFEND026)吸取少許內膜組織，應用免疫組化方法進行檢測Galectin-3：所有患者均采用控制性超排卵長方案：促排卵周期的前1周期的黃體中期(即排卵后1周左右)肌注達菲林(法國IP-SEN公司，3.75 mg/支，產品批號：U056)1.1 mg，肌注后第14天開始，據患者卵泡發育及血性激素情況情況肌肉注射果納芬，結合血激素情況，當主導卵泡≥1.8 cm時停用果納芬。當日根據患者血激素及卵泡數量情況，肌肉注射促卵泡成熟劑HcG6000-10000Iu。注射HCG 36 h后，用穿刺取卵針在經陰道超聲引導下依次取出直徑≥1.4 cm卵泡，當日男方采集精液，精卵取出成功后行精卵體外受精、胚胎培養。依據患者年齡和胚胎質量情況，宮腔內移植2～3枚可用胚胎，取卵當日根據患者血激素水平及獲卵情況，常規予黃體酮類藥物黃體支持至孕3個月，胚胎移植術后口服常規參芪壽胎丸方。對照組31例，中藥改為復方六味地黃顆粒，余方案同前。

1.2.4 隨訪 患者ET后14 d常規就診于醫院行血清β-HCG檢查，陰性者診斷為未孕，同時停用保胎藥物，陽性者診斷為生化妊娠，期間腹痛及陰道流血等不適者，隨時就診，ET后5周就診于醫院行陰道超聲檢查，宮內見胎囊、胎芽反射及胎心者診斷為臨床妊娠，胚胎著床于子宮腔以外者診斷為異位妊娠。

1.2.5 觀察指標 1)2組患者中醫腎氣陰兩虛癥候評分；2)2組患者子宮內膜中Galectin-3表達；3)2組患者臨床妊娠率。

1.2.6 免疫組織化學結果判斷標準 以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性結果，具體免疫組織化學結果判斷標準參考第四軍醫大學趙彤等采用的方法[6]。

2 結果

2.1 2組患者腎氣陰兩虛癥狀 治療組比對照組療效顯著，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、表2、表3。2組患者用藥前腎氣陰兩虛證候積分比較，可以明顯看出差異無統計學意義(P>0.05)，2組患者治療后腎氣陰兩虛證侯積分較治療前下降明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。治療組患者腎氣陰兩虛癥狀改善程度明顯優于對照組。

表1 2組患者HCG日腎氣陰兩虛證候積分的比較

表2 治療組患者治療前后腎氣陰兩虛證候積分的比較

表3 對照組患者治療前后腎氣陰兩虛證候積分的比較

表4 2組患者臨床妊娠率的比較

圖1 2組患者臨床妊娠率比較

2.2 2組患者臨床妊娠率比較 治療組臨床妊娠率明顯優于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖1。

2.3 2組患者胚胎著床期Galectin-3比較 2組子宮內膜中Galectin-3均有表達，但治療組表達明顯增強于對照組，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 2組患者胚胎著床期Galectin-3的比較

圖2 Galectin-3的免疫組化染色

注：棕黃色顆粒為陽性細胞。

由表5，圖2可知，治療組與對照組患者胚胎著床期Galectin-3比較差異有統計學意義(P<0.05)，治療組患者子宮內膜中Galectin-3的表達明顯高于對照組。

3 討論

降調節(Down Regulation)是IVF-ET控制性超排卵長方案中重要環節,可明顯提高IVF-ET的成功率,同時也降低子宮內膜容受性[7],是現代輔助生育技術帶來的產物。連方、張建偉、劉卉等[8-10]研究發現IVF-ET周期中子宮內膜容受性低下的主要病機是腎氣不足,腎陰虧虛。垂體降調節后,藥物促使多個卵細胞發育成優勢卵泡甚至成成熟卵泡,引起人體肝血及腎精的相對不足,進而使機體處于特殊病理階段。腎精腎氣不足,陰精失于濡養、陽氣難以化生,導致腎陰陽失衡、腎氣的衰弱加劇,天癸日漸衰竭,進而損傷沖任二脈的通調,最終導致生殖功能衰退,甚至子宮內膜容受性的下降[11-12]。

Galectin-3是一個29 Kad到35 Kad的蛋白,是半乳糖凝集素家族中的一員[13],子宮內膜容受性及妊娠均受其影響,其具有多種生物學功能:1)影響細胞黏附；2)調節多種細胞生長；3)與雙陰性胸腺細胞結合,介導T細胞和胸腺細胞凋亡；4)參與新生血管的形成。Galectin-3出現在人子宮和胎盤中,對子宮內膜細胞的增殖及黏附過程起著重要的增強作用,在胚胎著床、胚胎發生和胎盤形成過程中也有著重要作用,促進胚胎的種植與生長發育過程中新生血管的形成，從而保證胚胎順利著床和發育。這同時也與其在子宮內膜著床窗口期表達高,介導胸腺細胞和T細胞的凋亡,抑制子宮內膜免疫密切相關[14-15]。其表達缺失和下降,可影響子宮內膜的黏附力,導致子宮內膜容受性降低,進而影響胚胎在內膜上的粘著及侵入,最終導致胚胎著床障礙或流產。妊娠早期Galectin-3表達下降可導致絨毛、蛻膜發育異常,母胎免疫失衡,絨毛與子宮內膜間作用異常,胚胎發育異常,甚至凋亡,最終導致不孕、不育[16]。

腎主生殖,同時為免疫之本,可以有效調節免疫系統,腎的平衡與調節在機體的免疫中起著重要作用。腎虛可導致下丘腦—垂體—腎上腺—胸腺(HPAT)軸功能低下及免疫防御和免疫調節功能障礙,其是神經內分泌免疫網絡中的重要組成部分,腎陽虛的則其減退，腎陰虛則其增強,導致生殖免疫異常,甚至不孕、不育。子宮內膜中存在大量免疫物質,例如若子宮內膜中T淋巴細胞異常升高,則不利于胚胎著床,進而影響子宮內膜的容受性[17]。研究發現正常增生期子宮內膜中T淋巴細胞占45%,分泌期及妊娠早期由于NK細胞數量的增加T細胞的含量相對減少,僅占5%～10%,子宮內膜對這個胚胎才不會表現出排斥現象,表現良好的接受狀態，胚胎才可順利著床。著床窗口期子宮內膜的這種接受狀態被稱為子宮內膜容受性,是胚胎順利完成黏附及植入的必備條件[18-19]。子宮內膜容受性這一概念在中醫學中雖沒有明確提出，但古代醫家也早已探索出受孕的生殖規律。胞宮氣血滿盈,開啟著床窗,及表現良好的接受狀態,即子宮、胞脈陰精陽氣充盈,腎陰、腎陽相互作用,陰陽交媾則胎成。有研究證明,補腎中藥可抑制HPAT軸,其通過所產生細胞因子來影響抑制系統[20-21]。

復方二至天癸顆粒不僅可有效改善治療腎氣陰虛病癥，近年來其中部分中藥成分改善免疫功能得到越來越多的認證[22]，其中女貞子[23]有對小鼠的“陰虛”癥狀有良好的免疫調節作用。墨旱蓮[24]亦對小鼠外周血中T淋巴細胞百分率有顯著提高作用。菟絲子[25]在不孕癥的治療中廣為大量應用，有免疫調節、抗衰老、抗氧化、改善生殖內分泌等作用。枸杞子可干預神經內分泌免疫調節網絡，有效調節體液免疫、細胞免疫功能。當歸有雙相調節作用，增強機體免疫功能，保護肝臟和腎臟等作用[26-27]，上述諸藥合用可以有效的調整生殖免疫功能。

本實驗研究發現均2組中藥均可有效改善IVF-ET患者腎氣陰兩虛的癥狀，治療組明顯優于對照組，臨床妊娠率亦高于對照組，具有統計學意義，說明復方二至天癸顆粒比復方六味地黃顆粒能更有效的改善IVF降調周期腎氣陰兩虛的癥狀。經免疫組化法分析結果顯示在治療組和對照組中均有Galectin-3表達，在治療組中表達明顯弱于對照組，即復方二至天癸顆粒能增強子宮內膜中Galectin-3表達。

本實驗研究發現復方二至天癸顆粒增強子宮內膜中Galectin-3表達，提高IVF周期中患者的臨床妊娠率，這可能與Galectin-3調節子宮內膜的免疫活性細胞，引起子宮內膜免疫抑制的作用有關，本研究通過分子水平檢測子宮內膜中Galectin-3表達，進一步闡釋補腎中藥復方二至天癸顆粒在改善子宮內膜容受性作用中的優勢，從Galectin-3的角度進一步解析胞宮為“藏而不泄”“腎主生殖”“腎主免疫”的機制。

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(2015-11-07收稿 責任編輯：徐穎)

Effect of Erzhi Tiangui Granules on the IVF Cycle Endometrial Galectin-3

Zhang Juntan1,Lian Fang2,Zhao Di3

(1ReproductiveMedicineCenterofZaoZhuangMaternalandChildHealthHospital,Zaohzhuang27700,China;2ShandongChineseMedicineUniversityAffiliatedHospital,Jinan250011,China)

Objective:Observe the effect of Erzhi Tiangui granule on IVF-ET (IVF-ET) in preparing the endometrium period galectin-3 (Galectin-3),and its mechanism in improving the endometrial receptivity and increasing the possibility of pregnancy.Methods:Patients in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) preparation cycle were randomly divided into two groups,with 31 cases in the treatment group and 31 patients in the control group.The control group was given Liuwei Dihuang pills for cycles,and the treatment group was given Erzhi Tiangui granules for the same period.On the second cycle of menstruation,the 21 st day,extract a small amount of endometrial for detection of Galectin-3.At the same time,evaluate the kidney qi deficiency score and conceive rate of the two groups.Results:Kidney deficiency in both groups of patients were improved and treatment group more significantly (P<0.05).Galectin-3 expression in the treatment group also improved more obvious than that of the control group (P<0.05).As to clinical pregnancy rate,the treatment group performed better than the control group (P<0.05).Conclusion:Erzhi TianGui granules can improve patient′s clinical pregnancy rate in IVF cycle.This may relate to its enhancement of the expression of Galectin-3 in the endometrium and endometrial immune suppression.

Galectin-3; Nourish kidney; Erzhi Tiangui granules; Endometrial receptivity; Immune

國家自然科學基金項目——基于體外受精-胚胎移植卵巢顆粒細胞基因組學的腎主生殖理論研究(編號：81273790)；國家自然科學基金項目——基于蛋白質組學的腎主生殖理論研究(編號：81072836)；國家自然科學基金項目——基于關鍵基因表達調控網絡的腎主生殖理論研究(編號：81473720)

R242；Q132.1+1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.008