醒腦靜介導PI3K/AKT信號通路影響老年患者術后認知功能的臨床研究

吳俊山 張 銓

(福州總醫院九五臨床部麻醉科,福州,351100)

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醒腦靜介導PI3K/AKT信號通路影響老年患者術后認知功能的臨床研究

吳俊山 張 銓

(福州總醫院九五臨床部麻醉科,福州,351100)

目的:觀察醒腦靜對下肢矯形手術的老年患者術后認知功能,探討其基于腦脊液中PI3K/AKT信號通路的作用機制。方法:選取2015年8月至2016年1月我科收治的擬行下肢矯形手術ASAⅠ～Ⅱ級老年患者90例,隨機分成對照組和觀察組,每組45例。觀察組在患者術畢清醒時注射醒腦靜注射液20 mL,對照組注射等量生理鹽水。在術前1 d及術后3 d,7 d使用術后恢復質量評估(Physician Quality Reporting System，PQRS)量表新認知評價體系評估患者的認知功能水平。利用蛋白免疫印跡法檢測蛛網膜下腔穿刺置管成功后(T0)、插入喉罩后即刻(T1)及手術后6 h(T2)、24 h(T3)和48 h(T4)不同時間點腦脊液中PI3K、AKT、pAKT、Bcl、Bax的濃度。結果:1)術后2組患者認知功能均出現降低,對照組變化較觀察組明顯,2組患者術后7 d的MMSE評分恢復正常,而PQRS評分則顯示患者仍存在認知功能缺損。2)PQRS評分顯示,對照組術后發生術后認知功能障礙(Postoperative Cognitive Dysfunction,POCD)14例(40%),觀察組術后發生POCD10例(28%);MMSE評分顯示,對照組術后發生POCD12例(34%),觀察組術后發生POCD8例(23%)。PQRS評分顯示POCD發生率明顯高于簡易智能量表(Mini-mental State Examination,MMSE)評分(P<0.05)。3)Western blotting結果顯示:與T0相比,2組T1、T2、T3及T4時間點PI3K、pAKT、bcl水平明顯降低,而bax水平明顯升高,其中各時間點對照組各標志性蛋白水平變化的趨勢較觀察組明顯(P<0.05)。結論:醒腦靜可促進老年人下肢矯形手術患者術后認知功能的盡快回復,其影響機制可能與介導PI3K/AKT信號通路的標志性蛋白表達水平有關。

醒腦靜;認知功能;老年;術后;PI3K/AKT信號通路

認知在醫學心理學的定義是人體感知外界事物,是機體目的性明確地去認識外界事物,從而獲取相關信息,用于對問題的解決,從而形成對事物的認識或經驗的一種心理行為過程[1]。認知功能障礙即對外界事物的感知出現錯亂或者遲鈍的現象,其所造成的傷害遠大于器質性病變,給患者帶來的痛苦將嚴重影響其生活、工作和對社會的適應,同時給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔和資源浪費[1-2]。有些患者尤其是老年人在進行手術治療后出現中樞神經系統并發癥,表現為社交能力減弱、記憶力減退、認知能力及技巧退化,這類表現統稱為術后認知功能障礙(Postoperative Cognitive Dysfunction,POCD)[3]。目前認為POCD的發病機制尚不十分明確,有的臨床研究認為其與年紀大、麻藥不良反應、手術創傷、炎性反應因子等因素密切相關。諸多學者共同參與的一項多中心大樣本的調查研究后發現,在一項在術后早期使用醒腦靜,利用其通竅醒腦的功效,可促進老年患者術后認知功能的盡快恢復,因此POCD的發生率的降低與醒腦靜使用情況的關系是目前臨床探討的熱點話題[4]。近年研究發現PI3K/Akt通路的激活可維持神經元細胞的翁廷,參與調節中樞神經系統的凋亡和自噬管理著細胞的存活,并和機體的神經系統的學習和記憶等多種生理功能有莫大關聯[5-6]。因此我們大膽提出假設:醒腦靜對POCD程度有影響,是否通過PI3K/Akt信號通路進行關聯？在此基礎上,本研究擬通過觀察醒腦靜的使用對腰麻下下肢矯形手術老年患者術后認知功能及腦脊液中PI3K/Akt信號通路中標志性蛋白的變化,以期尋找適宜的藥物以緩解老年患者術后POCD的程度,為目前熱門的臨床診療提供切實可行的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年8月至2016年1月收住我科的擬行下肢矯形手術ASAⅠ～Ⅱ級老年患者90例,隨機分成對照組和觀察組,每組45例,年齡64～85歲,平均年齡(64.2±5.92)歲。均無認知功能障礙,MMSE評分≥22分;無合并明顯心、腦、腎等重大臟器疾病;無精神異常史,無服用鎮靜催眠藥物史;無脊柱畸形精神疾病史及家族史[7]。2組患者年齡、性別、體重、ASA分級比較差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。見表1。

1.2 研究方法 將90例入選患者術前禁食12 h,禁水4 h,采用靜注咪達唑侖1 mg,以1%利多卡因20 mL經腹股溝入路在神經刺激儀引導下行患肢股神經阻滯,效果確切后側臥于手術床上,患肢在上,選擇L4-5間隙,以改良Tuohy穿刺針行硬膜外穿刺成功后,使用連續腰麻導管(22G,Spinocath導管,美國Braun公司)通過Touhy針刺入蛛網膜下腔,拔出針芯后將Spinocath導管向頭側置入4 cm,見腦脊液后注入0.375%布比卡因輕比重液(0.75%布比卡因和注射用水1∶1體積混合)2.7 mL,速率0.05 mL/s,10 min后用冰塊測試溫度阻滯平面,如未達T10則追加0.5～1 mL[8]。麻醉平面穩定在T10后,靜脈注射丙泊酚1～2 mg/kg,芬太尼1 μg/kg,置入喉罩接麻醉機保留自主呼吸,分別吸入七氟烷,使CSI維持在適當的程度。術中監測心電圖、無創血壓、脈搏氧飽和度、心率,行右頸內靜脈穿刺置管監測中心靜脈壓,行左橈動脈穿刺置管監測直接動脈壓和采血查動脈血氣,接電阻抗無創心排血量監測儀連續監測心排血量、外周血管阻力、肺循環阻力,連續監測CSI。手術結束時停止吸入七氟烷,靜脈注射舒芬太尼0.1 μg/kg和地塞米松5 mg,待CSI恢復至90以上時拔除喉罩?；颊叻习喂苤刚鲿r拔除氣管內導管,在患者生命體征平穩、呼之睜眼時,觀察組患者予以醒腦靜注射液20 mL混合生理鹽水20 mL靜脈注射,對照組單純予以生理鹽水40 mL靜脈注射,2組患者均在1 min之內內推注完畢。術后患者自控鎮痛用藥為舒芬太尼150 μg、格拉司瓊8 mg、納絡酮0.4 mg用生理鹽水稀釋至100 mL,背景輸注速度2 mL/h,患者自控鎮痛0.5 mL/min,鎖定時間15 min。

1.3 觀察指標

表1 2組患者一般資料的比較

1.3.1 PQRS量表評分 在術前1 d及術后3 d、7 d使用PQRS量表新認知評價體系評估患者的認知功能水平,包括定向力、復述數字(正序/倒序)、回憶語句、組詞能力[9]。以術后評分-術前評分的差值為評定標準,定向力≥0分;正序復述數字≥2分;倒序復述數字≥1分;回憶詞語≥3分及組詞≥3分[10]。出現上述5項中的任何一項即認為出現POCD。

1.3.2 MMSE量表評分 該量表包括時間、空間定向力、遲記憶力、注意力及計算力,語言表達力等,總分為30分,<23分為認知功能缺陷[11]。

1.3.3 腦脊液中PI3K/Akt信號通路標志性蛋白 將腦脊液標本以3 000 r/min 4 ℃離心 10 min,收集上清,再根據DAB方法對所提蛋白液進行濃度測定,之后以100 μL蛋白液中加入25 μL的上樣緩沖液于100 ℃金屬浴中變性,接著可按照每泳道上樣量為50 μg蛋白,計算上樣量,電泳(4%濃縮膠,12%分離膠,120 V,50 mA,1.5 h)結束后將凝膠取出,用PVDF膜轉印,遵循膠在負極,膜在正極的原則,50V,100 mA,2 h,5%脫脂奶粉液的封閉2 h,TBS洗3次,5 min/次,分別加入5%脫脂奶粉按1∶1 000稀釋的抗PI3K、p-Akt、bcl、bax和β-actin抗體(1∶1000),4 ℃孵育過夜,TBS洗3次,每次5 min,加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫2 h,TBS洗3次,5 min/次[12]。將濾膜放人配好的顯色液中顯色15～30 min,計算機掃描圖像,并由生物圖像分析系統Bio-Rad公司,Model gel Doc 2000,美國)分析處理。

2 結果

2.1 2組患者認知功能評分比較 2組患者術前1 d PQRS評分及MMSE評分比較差異均無統計學意義(P均>0.05),2組患者術后3 d、7 d PQRS評分均明顯低于術前1 d(P均<0.05),且各時間點PQRS評分對照組均明顯低于觀察組(P均<0.05);2組術后3 dMMSE評分均明顯低于術前1 d(P均<0.05),且對照組明顯低于觀察組(P<0.05),2組患者術后7 dMMSE評分與術前1 d比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表22組患者術前術后各時間點認知評分的比較,分)

注：與術前1 d比較,*P<0.05;與CSI-50組比較,△P<0.05。

2.2 2組患者不同評分手段POCD發生率的比較 PQRS評分顯示,對照組術后發生POCD14例(40%),觀察組術后發生POCD10例(28%);MMSE評分顯示,對照組術后發生POCD12例(34%),觀察組術后發生POCD8例(23%)。PQRS評分顯示POCD發生率明顯高于MMSE評分(P<0.05)。

2.3 2組患者PI3K/AKT信號通路標志性蛋白濃度比較 與T0相比,2組T1、T2、T3及T4時間點PI3K、pAKT、bcl水平明顯降低(P均<0.05),而bax水平明顯升高(P均<0.05),其中各時間點對照組各標志性蛋白水平變化的趨勢較觀察組明顯(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 2組PI3K/AKT信號通路各標志性蛋白水平

3 討論

隨著目前國民經濟的飛速發展,人口老齡化越來越嚴重。年紀大,對外界抵抗力降低,且自身功能水平下降,越發容易患病。老年人患病手術率很高,且因年齡大、基礎病多、免疫力低下,手術風險也加大,因此,對于老年人的手術,大部分采取全麻方式。隨之而來的就是全麻的并發癥:POCD。而中醫學中和POCD相關的記載多為“健忘”“善忘”“癡呆”等,《醫林改錯》從病位上分析曰:“靈機記性皆在腦”,腦為元神之府,由此可知POCD目前關于POCD的病位主要在腦部。導致POCD的主要病因無外乎本虛和標實,本虛是腎精不足人亦喜忘,源于“腎主智,腎虛則智不足”論,腎精化生而成腦髓,其充盈程度直接影響腦髓的功能,假若腎精不足,腦髓空虛,人的思維、認知等功能不能得以正常發揮,人的智力就會減退;標實有“瘀血也令人善忘”由王清任提出,瘀血阻滯,腦失所養,神機之源不足,清陽之竅蒙蔽,以致元神失養,腦脈閉阻,出現相應的諸如善忘、思維遲鈍等認知功能障礙;“痰火迷神”亦屬標實,思慮飲食不節等引起的痰火積聚,上擾清靈,蒙蔽清竅,神明不清,出現呆鈍癲狂、神昏健忘等而成呆病。多項研究均對其發病機制不甚了解。多數認為與年齡、麻醉方式、麻藥的不良反應等有關[13]。機制可能包括以下兩點:1)老年人神經系統神經元和軸突減少,這是全麻后易患POCD的首要原因,2)老年人隨著年齡增大,肝腎功能降低,麻藥經腎臟排泄水平降低,造成麻藥在體內堆積,不良反應隨之加大,這也是發生POCD的重要原因之一[14]。Bedford于上世紀50年代首次提出老年患者術后出現癡呆,而POCD的概念是近10年才被被引起重視并深入研究。

表3 2組PI3K/AKT信號通路各標志性蛋白/內參IOD比值的比較

注：與T0比較,*P<0.05;與CSI-80組比較,△P<0.05。

近期有研究表明,術后早期使用醒腦靜,可促進老年患者術后認知功能的盡快恢復,因此POCD的發生率的降低與醒腦靜使用情況關系密切。醒腦靜注射液是基于安宮牛黃丸改變呈的水溶性靜脈注射液,成分含有麝香、冰片、梔子和郁金等。其中的麝香芳香氣味,能開竅醒腦,而冰片和麝香聯用,加強它通竅醒腦功效的同時,可以去火排毒。上述幾味中藥配合,可興奮中樞神經,緩解腦水腫和缺氧的狀態[15]。同時有動物實驗證實,醒腦靜注射液可明顯抑制氧自由基ROS的水平,促進細胞凋亡,護腦作用的同時,可對記憶力和學習能力的提高有幫助[16]。

在醒腦靜對患者認知功能的影響時,使用傳統MMSE評分法進行認知功能評定顯示2組患者于術后24 h均伴有MMSE評分顯著降低,但至術后7 d 2組基本達到正常水平,而2組術后7 d PQRS評分雖均有提升,但是仍然低于術前1 d,并且PQRS評分顯示POCD發生率高于MMSE手段評估所得POCD發生率,說明雖然MMSE亦可體現術后認知功能變化,但其敏感度低于PQRS評分[17];同時發現不同時間觀察組,即使用醒腦靜的患者,認知功能評分均高于對照組,說明醒腦靜對促進老年患者認知功能的恢復方面效果顯著。

隨著學者對POCD研究的逐漸深入,認為老年人發生POCD的機制與中樞神經退行性改變關系密切,而細胞凋亡是神經退行性改變的主要方式。PI3K/Akt[18]經典的抗凋亡信號轉導通路,它通過影響下游凋亡相關蛋白、細胞周期調節蛋白等效應分子的活化過程,在細胞的增殖、凋亡、膜泡轉運和細胞的惡性轉化等眾多病理生理過程中起重要作用。PI3K是磷脂激酶家族中的重要成員,具有特異的催化磷脂酰肌醇脂類物質的激酶作用,也是參與細胞內信號轉導的信號分子之一,功能上是蛋白激酶B(Akt Protein Kinase B,AKT)活化的首要調節者。在中樞神經系統病變時被證明該通路在損傷后被激活,并可以通過多種途徑發揮抗凋亡作用,PI3K/Akt信號傳導調節bcl-2家族成員的活性,PI3K依賴性的Akt的激活可以使促進細胞凋亡蛋白Bad磷酸化,而抑制細胞凋亡蛋白bcl-2發揮抗凋亡作用,PI3K/Akt通路的激活,還可以使促進細胞凋亡蛋白bax磷酸化而失活,從而抑制細胞凋亡,另活化的Akt能夠阻止線粒體釋放細胞色素C及凋亡誘導因子,從而抑制細胞凋亡。近年研究顯示,PI3K/Akt通路作為促存活信號,參與了逆轉中樞神經退行性改變的作用,它的激活在保護神經細胞,PI3K/Akt通路通過調節神經系統的凋亡和自噬管理著細胞的存活。本研究利用Western blotting技術檢測不同時間點腦脊液中PI3K/Akt信號通路上標志蛋白的水平變化,結果顯示不同時間點PI3K、pAKT、Bcl、bax水平的確發生了變化,其中各時間對照組各標志性蛋白濃度變化的趨勢較觀察組明顯。提示不論何種深度麻醉均可造成PI3K/Akt信號通路的改變,因此認為POCD的發生與細胞凋亡關系密切,且可能通過PI3K/Akt信號通路進行鏈接。

綜上所述,醒腦靜對老年下肢矯形手術患者術后認知功能的恢復作用顯著,此機制可能與介導PI3K/AKT信號通路的標志性蛋白表達水平有關。

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(2016-05-27收稿 責任編輯：王明)

Clinical Studies of Xingnaojing Mediated PI3K/AKT Signaling Pathway on Cognitive Function of Elderly Patients after Surgery

Wu Junshan, Zhang Quan

(TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMilitaryRegion,FuzhouGeneralHospitalortho-pedicPutian,Fujian351100,China)

Objective:To observe Xingnaojing′s effect on postoperative cognitive function in elderly patients with lower limbs orthopedic operation, and to discuss its influence on PI3K/AKT signal pathway in the cerebrospinal fluid. Methods:A total of 90 cases of elderly patients with lower limbs orthopedics ASA Ⅰ ～ Ⅱ grade in our hospital during August 2015 and January 2016, were included into the study. According to the random principle, they were divided into observation group and control group. Cognitive function levels of the patients were assessed by postoperative recovery Physician Quality Reporting System (PQRS) the new cognitive evaluation system on one day before the surgery, and 3 d and 7 d after the surgery. The PI3K, AKT, pAKT, Bcl, and Bax concentration changes in cerebrospinal fluid were detected by western blotting in the following time points:the finished time of the subarachnoid puncture catheter (T0), the time when inserting a laryngeal mask (T1), 6 h(T2), 24 h(T3), 48 h (T4) after the operation. Results:1) According to PQRS score and MMSE score of postoperative cognitive function in the patients, the scores of the two groups reduced, the changes of control group were more obviously than the observation group, MMSE scores got back to normal in both of the two groups 7 d after operation, while the PQRS scores showed that there were 14 cases (40%) in the control group, while 10 cases (28%) in the observation group; while MMSE scores showed that there were 12 cases (34 %) in the control group, while 8 cases (22%) in the observation group, the result of PQRS scores significantly higher than MMSE scores.3) Western blotting results showed that the concentration of PI3K, pAKT, Bcl decreased in the two groups on time points of T1, T2, T3, and T4 compared with the T0, while the Bax levels rose. The iconic protein concentration change trend of every time point of the control group was more obviously than the observation group, the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion:Xingnaojing can improve the postoperative cognitive function in elderly patients with lower limbs orthopedic surgery, the mechanism may be related to the mediation on iconic protein expression levels of PI3K/AKT signal pathway.

Xingnaojing; Cognitive function; Old aged patients; Post-surgery; PI3K/AKT signaling pathway

國家自然科學基金青年項目(編號:30600795)

R256.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.013