免疫復合法建立大鼠潰瘍性結腸炎模型的探討

常孟然 林 燕 李文靜 趙程博文 王紅彬

(北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029)

?

實驗研究

免疫復合法建立大鼠潰瘍性結腸炎模型的探討

常孟然 林 燕 李文靜 趙程博文 王紅彬

(北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029)

目的：探討免疫復合法和化學法建立大鼠潰瘍性結腸炎模型的優劣，尋求更接近人類發病機制的潰瘍性結腸炎動物模型。方法：將Wistar大鼠隨機分成正常組、免疫復合組和化學組，免疫復合組前3周每周給予抗原乳化液(含異體抗原8 mg)注射1次，共注射3次，第4周免疫復合組和化學組均用100 mgTNBS/kg+50%乙醇灌腸。分別于造模后第1天、第14天、第56天取材，比較造模后各組大鼠的癥狀、體征、病理反應等方面的變化。結果：與正常組比較，免疫復合組與化學組在造模后第1天均出現稀溏便、潰瘍、炎性反應等典型潰瘍性結腸炎病變，但免疫復合組黏膜下層炎性反應劇烈，維持時間長達8周，化學組潰瘍較免疫復合組深，但黏膜下層炎性反應強度不及免疫復合組，潰瘍持續時間短，2周后趨向自愈。結論：免疫復合法模型表現穩定，重復性好，病變持續時間長，發病機制更類似人類潰瘍性結腸炎，是較為理想的潰瘍性結腸炎模型。

免疫復合法；化學法；潰瘍性結腸炎；大鼠模型

潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis，UC)，又稱慢性非特異性結腸炎，是以大腸(結腸與直腸)黏膜與黏膜下炎性反應為主要特征的病變。臨床表現以反復發作的腹瀉、腹痛、黏液膿血便和里急后重為主。病程呈慢性過程，發作期與緩解期交替，少數癥狀持續并逐漸加重，遷延難愈。UC發病機制尚不明確，目前認為主要與遺傳、環境、免疫等因素有關[1]，其中免疫異常被認為是UC發病的重要因素[2-3]。近年來UC發病率呈上升的趨勢[4]，UC發病機制與藥物療效的實驗研究已成為醫學界關注的重點，因此選擇何種動物模型對UC的實驗研究意義重大。實驗表明，免疫復合法重復性好，病變更類似人類UC，持續時間長，是較理想的造模方法[5]。本實驗通過對免疫復合法與化學法獲取的UC模型進行比較，試圖為免疫損傷致瘍更能獲得類似人類發病機制的UC動物模型尋求客觀依據。

1 材料

1.1 實驗動物 Wistar大鼠66只，雄性，SPF級，體重約120 g，由北京斯貝福實驗動物有限公司提供。實驗用家兔9只，雄性，體重約2 kg，由北京興隆動物養殖有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器 三硝基苯磺酸和完全弗氏佐劑(Sigma)；BCA蛋白濃度測定試劑(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；無水乙醇、水合氯醛、4%多聚甲醛溶液(國藥集團化學試劑北京有限公司)；恒溫高速離心機(Eppendorf，型號5810R)；紫外分光光度計(UNICAM，型號HE10Sα)。

2 方法

2.1 分組與造模 將Wistar大鼠隨機分成正常組18只、免疫復合組24只和化學組24只。刮取家兔結腸黏膜后組織勻漿，漿液以12 000 r/min速度離心15 min，取上清液與等量完全弗氏佐劑配成抗原乳化液，分別于適應性飼養后第1周、第2周、第3周在大鼠腹股溝皮下注射，每只每次注射8 mg抗原蛋白，現配現用。第4周，將禁食(不禁水)48 h的大鼠用3.5%水合氯醛按1 mL/100 g麻醉后，用石蠟油涂于灌胃針外，從大鼠肛門輕柔插入結腸約5 cm后，按100 mgTNBS/kg+50%乙醇劑量緩慢灌腸，倒置1 min后傾倒平躺放置5 min。化學組前3周不注射抗原乳化液，第4周操作與免疫復合組相同。

2.2 取材 各組于造模后第1天、第14天、第56天禁食(不禁水)48 h后麻醉取肛門上端2 cm處結腸5 cm，沿腸系膜縱行切開，展開用生理鹽水洗凈，4%多聚甲醛溶液固定后編號，常規石蠟包埋行HE染色。

2.3 觀察指標 1)外觀體征；2)解剖開腹后肉眼觀察腹腔整體狀態、結腸大體形態及結腸黏膜損傷程度；3)光鏡下觀察病理HE染色切片。

2.4 統計學方法 實驗數據采用(均值±標準差)表示，用SPSS 20軟件對數據作統計分析，2組間正態分布比較采用T檢驗，偏態分布用非參數檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況 免疫復合組大鼠每次注射抗原乳化液后，活動減少，毛色及光澤度較正常略淺，飲食減少。免疫復合組和化學組在造模完成后第1天，均逐漸出現懶動、食少、大便次數增多、軟便或稀便、大便末端有黏液，毛色逐漸變暗、光澤度差，第3天最為嚴重。免疫復合組大便溏表現時長約為2周，便質稀軟直至第8周，活動減少、飲食減少、毛色澤差持續時間約為8周；化學組癥狀持續2周后，第3周活動飲食及毛色逐漸開始好轉。

3.2 形態學表現 根據潰瘍、炎性反應及損傷程度，每只大鼠結腸得分為3項得分之和，參照CMDI評分體系(表1)，各組結果如下(表2)。

表1 CMDI評分標準

表2 各組不同時間CMDI評分比較

注：*與化學組比較P<0.01，◇同組內第1天比較P<0.05，△第56天形態學表現無潰瘍和炎性反應。

3.3 病理表現 光鏡下正常組可清楚地觀察到細胞形態正常，各層結構完整，上皮排列整齊，結腸腺規則，杯狀細胞豐富；黏膜下層、肌層、漿膜層結構清晰，未見炎性細胞浸潤。

造模后第1天，免疫復合組與化學組均有黏膜腺體壞死脫落，黏膜上皮細胞大片脫落、壞死，潰瘍面可見滲出物，大量腺細胞萎縮，黏膜淺層結構消失、壞死；黏膜下層有充血、腫脹；肌層被破壞，部分肌纖維斷裂。免疫復合組潰瘍病變集中在黏膜肌層外，形成淺潰瘍，潰瘍邊緣腸腺細胞被破壞、排列紊亂，杯狀細胞明顯減少；黏膜下層有大量炎細胞浸潤。化學組形成明顯深潰瘍，潰瘍深達黏膜下層，黏膜下層有炎細胞浸潤，血管及淋巴管擴張。炎性反應化學組較免疫復合組輕。

造模后第14天，2組均有不同程度的自愈傾向，免疫復合組黏膜上皮細胞被破壞，黏膜層局部有缺損，部分腺細胞萎縮，仍為淺潰瘍，黏膜層有炎細胞浸潤，局部伴有充血，潰瘍病灶處淋巴細胞聚集；黏膜下層仍有出血、腫脹，炎細胞聚集，程度較前為輕，靜脈充血嚴重，淋巴管擴張，淋巴濾泡增多；有肉芽組織形成。化學組黏膜上皮脫落，腺細胞排列紊亂，萎縮細胞減少，纖維結締組織和血管增生明顯，黏膜下層輕度充血，有少量炎性細胞浸潤。

造模后第56天，免疫復合組未完全自愈，黏膜層上皮細胞缺損、腺細胞缺失，腺細胞增生、擴張，形成絨毛上皮，黏膜肌層仍有損傷；黏膜下層有炎細胞聚集，腫脹，血管壁充血、擴張，淋巴管擴張，淋巴濾泡增多；黏膜肌層增厚。化學組結腸組織結構與正常無明顯差異。

附2種造模法光鏡下的病理照片，如圖1。

圖1 2種造模法光鏡下的病理照片

注：以上均為光鏡下100倍圖片。

4 討論

UC病變部位主要限于結腸黏膜與黏膜下層，以潰瘍與炎細胞浸潤為主，故對模型成功與否應以此病理特征為判斷依據。本實驗設計造模后于第1、14、56天3個時間段取材，以觀察大鼠不同病程階段的結腸病理變化。上述結果表明：在UC急性期化學法模型病變程度明顯重于免疫復合法模型，病變累及范圍較免疫復合法模型局限，僅累及黏膜層，化學法模型病變持續時間短，近14 d可自愈；免疫復合法模型病變范圍廣而深，由黏膜層到黏膜下層，可累及全結腸甚至回腸末段，病變持續時間長，可維持8周以上，仍可見結腸壁增厚及炎性反應，急、慢性期的病理特征明顯。因此，免疫復合法造模病變持續時間長，潰瘍形成與炎性反應均有體現，完整地詮釋了UC急慢性不同時期的病理變化，更符合臨床UC的病理要求。UC屬自身免疫性疾病，其發病機制雖尚不明確，但目前認為其可能機制是在腸腔內抗原誘導下遺傳易感患者免疫反應過度激活引起的[6]。因此，本實驗先利用家兔結腸黏膜蛋白異體抗原刺激，使實驗大鼠腸道菌群失調，腸腔內致病菌和條件致病菌增多，且腸黏膜通透性增加，導致腸腔內細菌及/或細菌產物向黏膜固有層移位，引起免疫細胞的激活及炎性反應[7]，再用化學誘導，TNBS是一種半抗原物質，乙醇作為有機溶劑溶解腸黏膜表面的黏液，破壞腸黏膜屏障，使TNBS與腸組織大分子組織蛋白結合后成為完全抗原，導致針對腸黏膜的免疫反應，從而誘導UC的發生[8]。這種復合造模方法的原理與UC的發病機制是基本相符的。

其他的造模方法主要有免疫法[9]、復合法[10-11]、化學物質誘導法[12]、基因修飾模型和自發性動物模型[6]。化學刺激法操作簡單，成功率高，與臨床上UC的致病因素差異大，且模型自愈性極強，慢性期表現不如免疫復合法，與臨床UC病程表現不太一致。現普遍運用免疫復合法建立并獲取穩定UC模型，目前公認TNBS劑量在100 mg/kg時模型最為穩定[13]，對乙醇濃度有文獻報道50%為最佳，故TNBS灌腸劑量為100 mg/kg+50%乙醇。免疫法蛋白抗原劑量通常為8 mg。本實驗又在以下幾個方面做了改進：1)其他免疫法造模實驗中，多間隔2周給予兔腸黏膜制備的抗原乳化液(含抗原8 mg)共免疫2次[14]。本實驗每隔1周注射一次抗原乳化液，共注射3次，抗原刺激頻次加大，更加突顯免疫損傷的致病作用。2)通常實驗取家兔結腸黏膜制成組織勻漿為4 ℃離心，速度3500 r/min，離心時間30 min，而本實驗4 ℃12 000 r/min離心15 min，充分離心使抗原蛋白更細小，易被吸收并引發免疫反應。3)本實驗灌腸時未使用傳統的硅膠管，而用灌胃針代替，灌胃針可重復使用，口徑又較硅膠管小，同時質地較硬，經石蠟潤滑后容易插入肛門；與注射器連接緊密，灌腸過程中溢流量小，方便灌腸操作[15]，又可以減少人為機械損傷。

因此，本實驗注重免疫損傷對UC發病及病理的影響，在以往實驗的基礎上稍加技術改進，從而獲取了持續而穩定的、更符合人類UC發病機制的理想動物模型。

[1]徐陽,李偉光,劉海峰,等.三硝基苯磺酸誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型制備的技術改良[J].世界華人消化雜志,2012,20(2):106-112.

[2]陳治水,陳寧.潰瘍性結腸炎中西醫結合研究新進展[J].中國中西醫結合雜志,2012,32(4):437-442.[3]周婷婷,仝巧云.潰瘍性結腸炎發病機制的研究進展[J].胃腸病學和肝病學雜志,2012,21(12):1163-1166.

[4]惠毅,閆曙光,李京濤,等.大鼠慢性潰瘍性結腸炎模型建立方法探討[J].遼寧中醫藥大學學報,2013,15(10):62-65.

[5]解春靜,莊彥華,欒雨蘢.潰瘍性結腸炎發病機制中免疫因素的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志,2013,29(8):889-892.

[6]羅鳳燕,白愛平.潰瘍性結腸炎動物模型的研究進展[J].世界華人消化雜志,2013,21(7):607-613.

[7]Fava F，Danese S.Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease:friend of foe?[J].World J Gastroenterol，2011,17(5):557-566.

[8]范玉晶,裴鳳華,劉冰熔.潰瘍性結腸炎動物模型的研究進展[J].中華結直腸疾病電子雜志,2013,2(6):311-313.

[9]毛穎,王秀珍,張喆,等.潰瘍性結腸炎動物模型研究進展[J].中醫藥信息,2013,30(4):126-130.

[10]侯麗娟,唐方,王曉紅,等.潰瘍性結腸炎模型的建立及影響因素[J].世界華人消化雜志,2011,19(31):3242-3245.

[11]曹秀紅,張學彥,張曉娜.白介素在潰瘍性結腸炎發病機制中的研究進展[J].世界華人消化雜志,2011,19(30):3143-3148.

[12]王艷紅,葛斌,陳佳佳,等.潰瘍性結腸炎動物模型的研究進展[J].中國藥房,2011,22(25):2379-2382.

[13]徐陽,唐艷萍.潰瘍性結腸炎中西醫動物模型研究進展[J].中國中西醫結合外科雜志,2013,19(4):469-472.

[14]段征,汪維偉,姜蓉.兩種潰瘍性結腸炎大鼠模型的比較[J].重慶醫科大學學報,2008,33(1):66-68,72.

[15]張濤,謝建群.大鼠潰瘍性結腸炎模型的實驗研究[J].中國中西醫結合消化雜志,2006,14(4):240-242.

(2015-12-22收稿 責任編輯：張文婷)

Discussion on Establishment of Experimental Rats Model with Ulcerative Colitis by Immune Complex Method

Chang Mengran, Lin Yan, Li Wenjing, Zhao Chengbowen, Wang Hongbin

(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChinesemedicine,Beijing100029,China)

Objective: To screen an optimal ulcerative colitis animal model more close to the pathogenesis of human body by analysis of the strength and weakness between the immune complex method and the chemical method for establishing an experimental rat model. Methods: Wistar rats were randomly divided into normal group, immune complex group and chemical group. Rats in immune complex group are injected with antigen emulsion (including 8 mg variant antigen) once a week in the first three weeks. In the fourth week, the rats in the immune complex group and those in the chemical group were coloclystered by TNBS (2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonic acid sol, 100 mg/kg) and 50% alcohol. Colon samples from the three groups were taken at the 1 st, 14th and 56th day respectively and symptom, sign and pathological reaction of the three groups after modeling were compared. Results: Compared with the normal group, rats in the immune complex group and chemical group had typical ulcerative colitis symptoms at the 1 st day, like loose stool, ulcer, inflammatory reaction, while the submucosa inflammatory reaction of rats in the immune complex group was stronger than that of the chemical group lasting for eight weeks. The ulcer in the chemical group was more severe than that of the immune complex group, but submucosa inflammatory reaction weaker, with less duration and self-cures two weeks later. Conclusion: The immune complex model is the optical ulcerative colitis one, for stable performance, easily repeated, and long duration and the ulcerative colitis pathogenesis in rat model is much more close to that of human body.

Immune complex method; Chemical method; Ulcerative colitis; Rats model

國家自然科學基金項目(編號：81202682)——基于線粒體能量代謝探討潰瘍性結腸炎脾虛為本的病理基礎

R574.62；R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.041