外感清熱解毒方抗呼吸道病毒活性的體外實驗研究

侯天祿 詹恬恬 奚 安 胡毅翔 成 揚 平 鍵 陳建杰

(1 上海浦東新區傳染病醫院,上海,201299; 2 上海中醫藥大學附屬曙光醫院,上海,201203; 3 上海浦東新區中醫醫院,上海,201299; 4 浙江省醫學科學院浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室,杭州,310013)

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外感清熱解毒方抗呼吸道病毒活性的體外實驗研究

侯天祿1,2詹恬恬2奚 安3胡毅翔4成 揚1,2平 鍵2陳建杰1,2

(1 上海浦東新區傳染病醫院,上海,201299; 2 上海中醫藥大學附屬曙光醫院,上海,201203; 3 上海浦東新區中醫醫院,上海,201299; 4 浙江省醫學科學院浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室,杭州,310013)

目的:研究外感清熱解毒方體外抗呼吸道病毒的活性。方法:體外培養MDCK、HEL和A549細胞,分別接種流感病毒H1N1、腺病毒AV1和呼吸道合胞病毒RSV1,給予外感清熱方進行干預,以病毒唑作為對照。采用MTT法檢測藥物對細胞的毒性和對病毒的治療指數,采用紅細胞凝集實驗和觀察細胞病變(CPE)進行分析,研究該方抗呼吸道病毒活性。結果:外感清熱方對H1N1的IC 50為0.028 mg/mL,TI為2.07。預防給藥在0.01 mg/mL時紅細胞凝集實驗為陰性,表明該方能夠阻斷H1N1病毒入侵,有預防作用。治療給藥在0.01 mg/mL時紅細胞凝集實驗為陰性,表明該方對病毒有治療作用。直接殺傷實驗該方能夠降低病毒滴度1個梯度。在0.005 mg/m:時抗AV1紅細胞凝集實驗為陰性,表明該方能夠抑制AV1。鏡下觀察CPE表明0.01 mg/mL以上濃度的中藥能夠抑制RSV1。結論:外感清熱解毒方具有較好的抗H1N1、AV1和RSV1的活性,具有高效低毒的特點。

外感清熱解毒方;H1N1;AV1;RSV1;體外實驗

外感發熱常見于感冒和時行感冒,是四時門診中的常見病。致病因素除了少數為細菌感染之外,大多以呼吸道病毒感染為主。能夠引起呼吸道感染的病毒種類較多,目前臨床對于病毒性呼吸道感染的治療,仍以對癥處理為主,尚缺乏理想的抗病毒藥物與可靠的防治方案[1-3]。外感清熱解毒方系上海市浦東新區傳染病醫院結合中醫理論和臨床實踐擬定的經驗方,用于治療外感發熱具有較好的療效。為了深入探討該方的作用,我們研究了該方對常見呼吸道病毒的作用和細胞毒性,為進一步開發有效的防治藥物打下基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物和實驗動物 外感清熱解毒方,由黃芩、桔梗、蘆根、炙款冬花、蒼術等組成。按配比稱取單味中藥放入100 mL蒸餾水浸置30 min(液面浸沒中藥飲片2～3 cm),武火煮至沸騰后采用文火慢煎30 min,得過濾液50 mL;再向中藥中持續加入蒸餾水至浸沒藥材表面,再按煎煮方法進行煎煮,得過濾液50 mL,將前后2次所得過濾液歸并后濃縮至50 mL,并將過濾與放入4 ℃冰箱放置冷卻,靜置過夜,次日再次濃縮至25 mL,2 000×g離心,取上層清液,用蒸餾水定容至25 mL,標準濃度為2 g生藥/mL,進行分裝,消毒,低溫冷藏,備用。病毒唑由浙江亞洲制藥廠生產,中藥提取液和病毒唑分別使用含2.5%的小牛血清DMEM培養液稀釋成工作液。清潔級豚鼠,雌性,250 g,購于上海斯萊克實驗動物有限公司。9日齡SPF亨利雞雞蛋由浙江大學農業科學院提供。

1.2 病毒株、細胞株、主要試劑和儀器 A/PR/8/34甲型流感病毒(H1N1型)由浙江省動物中心提供。腺病毒AV1株、呼吸道合胞病毒RSV1株,由浙江省疾病預防控制中心提供。狗腎傳代細胞MDCK細胞、HEL細胞、A549細胞購于上海細胞研究所。EDTA購自中國醫藥集團,批號150204。胰酶為Biosharp公司產品,批號65126817。D-hanks液為南京凱基公司產品,批號20140605。小牛血清為浙江天杭公司產品,批號20150180。胎牛血清為Gibco公司產品,批號1616964。DMEM培養基為Sigma公司產品,批號#WXBB5403V。Galaxy170 s細胞培養箱Eppendorf公司產品。IX53型倒置顯微鏡為奧林巴斯產品。

1.3 流感病毒TCID50的測定 將MDCK細胞分裝培養完成后,吸取原培養液,使用D-Hanks液清洗2遍,并使用不含血清的培養液將流感病毒H1N1對倍稀釋成不同梯度,梯度如下:1/10、1/102、1/103、1/104、1/105、1/106,分別添加入24孔板,量為20 μL/孔,再添加10%血清培養液至1 mL/孔,每個濃度同時設置5個復孔,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養18 h,觀察細胞病變(Cytopathic effect,CPE)。實驗平行設置空白對照組。

1.4 外感清熱解毒方的細胞毒性實驗 另用0.25%的EDTA-胰酶3 mL將已經長滿單層的細胞消化并制成細胞懸液,將細胞按1×105個/孔添加入24孔板中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養18 h。后吸取原培養液,并使用D-Hanks液將細胞洗2遍,然后用不含血清的培養液將中藥或者病毒唑進行稀釋,分別添加入24孔板中,量為20 μL/孔,再次分別加10%血清培養液至1 mL/孔,各組設置5個復孔,置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。在顯微鏡下觀察CPE,連續4 d。實驗設立空白對照組。在試驗結束觀察完病變結果后,采用MTT法測定細胞存活率,吸去培養液并添加0.4 mg/mL的MTT液,量為100 μL/孔,置于37 ℃孵育4 h后丟棄上層清液,添加100 μL DMSO溶解,490 nm波長檢測OD值,并使用Reed-Muench法計算藥物對細胞的半數有毒劑量TC50。

1.5 外感清熱解毒方對呼吸道病毒的治療指數 在藥物干預病毒試驗完成后[4],采用MTT法測定細胞存活率,490 nm波長檢測OD值。病毒抑制百分率(%)=(藥物和病毒組OD值-病毒對照組OD值)/(細胞對照OD值-病毒對照OD值)×100%,并采用Reed-Muench法計算對病毒抑制率為50%時的藥物濃度IC50。治療指數(TI)=TC50/IC50,TI<1有毒無效,1≤TI<2低效有毒,TI≥2低毒有效。

1.6 外感清熱方對呼吸道病毒的抗病毒作用 紅細胞凝集試驗:豚鼠心臟取血,置肝素抗凝管中,使用0.9%生理鹽水洗滌3次,置于4 ℃、1 000 r/min×10 min,使用0.9%生理鹽水配制成0.5%豚鼠紅細胞懸液。在微量凹板中先滴入待測上層清液50 μL,再滴入豚鼠紅細胞懸液50 μL,同時設置生理鹽水對照4孔,30 min后觀察結果。

1.6.1 藥物的預防作用 待細胞長成單層后添加不同濃度的中藥和病毒唑,每個濃度設置復孔,同時設置病毒對照和細胞對照,置于37 ℃孵育過夜。后使用Hanks緩沖液洗滌2次,添加不同濃度病毒攻擊,每個濃度設置4孔,病毒吸附2 h后丟棄上層清夜,換成含2%牛血清的DMEM,放置于CO2培養箱中孵育4 d后,用紅細胞凝集試驗檢測。

1.6.2 藥物的治療作用 待細胞長成單層后添加病毒攻擊,同時設置病毒對照和細胞對照,每濃度設置4孔,病毒吸附2 h后丟棄上層清液。添加不同濃度的中藥和病毒唑,細胞對照和病毒對照分別添加含2%小牛血清的DMEM,放置于CO2培養箱中孵育4 d后,用紅細胞凝集試驗檢測。

1.6.3 藥物的直接殺傷作用 將無毒濃度下的待測藥物和病毒唑分別和毒力為100TCID50的流感病毒混合,病毒對照是將100TCID50的流感病毒與含2%小牛血清的DMEM混合,設置細胞對照4孔,放置于孵箱中培養24 h。取己長成單層細胞的培養板,丟棄培養液,添加入之前的藥物和毒液的混合液,按照10-1～10-5梯度稀釋,待測藥物、陽性藥物和病毒對照均設置5個濃度,每個濃度設置4孔,放置于CO2培養箱中孵育4 d后,用紅細胞凝集試驗檢測。

2 結果

2.1 病毒TCID50的測定 本實驗采用Reed-Muench氏法計算流感病毒H1N1導致的TCID50,出現50%的MDCK細胞病變的病毒濃度在10-4～10-5之間,通過計算得到病毒的TCID50為10-4.5/0.1 mL,即病毒液應稀釋31 622倍。RSV1和AV1病毒極難在體外擴增,故直接取用病毒原液,滴度為100TCID50。

2.2 藥物對MDCK細胞的毒性和抗H1N1活性 外感清熱方對MDCK細胞的TC50為0.058 mg/mL,對H1N1的IC50為0.028 mg/mL,TI為2.07。病毒唑的TC50為0.579 mg/mL,對H1N1的IC50為0.321 mg/mL,TI為治療指數為1.8。說明外感清熱方對H1N1具有良好的抑制作用,具有高效低毒的特點。見表1。

外感清熱解毒方在0.01 mg/mL時紅細胞凝集試驗為陰性,表明中藥作用MDCK細胞后,能夠阻斷H1N1病毒入侵,有預防作用。病毒唑0.5 mg/mL的紅細胞凝集試驗表現為凝集,表明沒有預防作用。見表2。

外感清熱解毒方在0.01 mg/mL時紅細胞凝集試驗為陰性,表明藥物對病毒有治療作用。病毒唑在濃度0.13 mg/mL時紅細胞凝集試驗為陰性,表明該藥對病毒有治療作用。見表3。

表1 藥物對MDCK細胞毒性和抗H1N1的活性

表2 藥物對H1N1誘導MDCK的預防作用

注：“-”表示抑制,“±”為50%抑制,“+”為不抑制。

表3 藥物對H1N1誘導MDCK的治療作用

注：“-”表示抑制,“±”為50%抑制,“+”為不抑制。

外感清熱解毒方減低了病毒滴度的1個梯度,陽性藥物病毒唑減低了2個梯度。見表4。

2.3 藥物抗AV1的活性 外感清熱解毒方在0.005 mg/mL時紅細胞凝集試驗為陰性,表明藥物作用細胞后,能夠有效阻止AV1病毒入侵,表明其有預防作用。病毒唑0.5 mg/mL的紅細胞凝集試驗為表現為凝集,表明沒有預防作用。見表5。

2.4 藥物抗RSV1活性 由于RSV1不能引起紅細胞凝集,故只能通過CPE評價藥物的抗病毒效果。鏡下觀察可見,A549細胞感染RSV1后,細胞膨脹、變形、大量壞死。給予0.065 mg/mL以上濃度的病毒唑可改善病毒誘導的CPE,提示病毒唑可抑制RSV1的增殖。給予0.01 mg/mL以上濃度的外感清熱解毒方時,能完全抑制RSV1,鏡下可見細胞排列密集,與正常形態基本一致。伴隨藥物濃度的遞減,達到0.001 3 g/mL時,細胞出現大片融合、破碎等病變,提示該方能夠抑制RSV1的增殖,呈現出量效關系。見表6、圖1。

表4 藥物對H1N1的直接殺傷作用

注：“-”表示抑制,“±”為50%抑制,“+”為不抑制。

表5 藥物對AV1誘導HEL的預防作用

注：“-”表示抑制,“±”為50%抑制,“+”為不抑制。

表6 藥物對RSV1誘導的A549細胞CPE的作用

注：(-)細胞正常生長,無病變出現。(+)1%～25%細胞病變少于整個細胞單層的。(++)26%～50%細胞出現病變。(+++)51%～75%細胞出現病變。(++++)76%～100%細胞出現病變。

圖1 各組藥物對RSV1感染A549細胞形態的影響(×100)

3 討論

在臨床疾病譜中,由病毒引起的疾病在感染類疾病中占比接近75%以上,尤其是呼吸道病毒感染最為常見[3]。近年來,不斷有新出現或再現的病毒感染引發新的疾病流行,使病毒性疾病的防治再次成為臨床工作的焦點[3,5]。根據研究發現,流感病毒是流行性感冒的病原體,分別是甲、乙、丙3型,其中以甲型流感威脅最大。甲型流感因病毒表面血凝素和神經氨酸酶抗原性不同,分為若干亞型。流感能夠影響所有年齡組的人,嚴重危害人類健康。由于抗原漂移和移位的后果,使得頻繁的和不可預知的病毒新突變株不斷出現,導致甲型流感疫苗不能有效防治已經發生的流感病毒感染。同時目前治療甲型流感的藥物大多有不良反應和耐藥性,限制了其臨床療效[6]。

天然植物藥由于來源廣泛,抗病毒作用正日益受到人們重視。Glatthaar-Saalmüller等研究發現,一種由龍膽根、報春花、接骨木花等組成的藥物,對智利1/83 H1N1病毒、呼吸道合胞病毒、人類鼻病毒B亞型、柯薩奇病毒亞型A9等均具有良好的廣譜抗病毒活性[7]。Sharma等研究了草藥紫錐菊對鼻病毒1a和14、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒的作用,以及對細胞因子的影響,結果發現紫錐菊能夠抑制病毒生長和促炎性細胞因子的分泌[8]。Kemmerich在一項雙盲、安慰劑對照、多中心的臨床研究中,評估了百里香藥草和櫻草根提取物對急性支氣管炎伴有咳嗽患者的療效,結果發現該提取物安全有效[9]。因此，從包括中草藥在內的天然植物藥中尋找有效的抗病毒藥物,無疑是一條行之有效的途徑[6,10]。

本研究結果可以看出,外感清熱解毒方在體外能夠有效地抑制H1N1、AV1和RSV1。該方對H1N1的治療指數為2.07,表明其具有低毒有效的特點。預防給藥的研究發現在0.01 mg/mL時紅細胞凝集實驗為陰性,提示該方可能是通過事先細胞的功能來抵御外邪,從而阻斷了病毒的復制。治療給藥的研究發現在0.01 mg/mL時紅細胞凝集實驗為陰性,表明藥物對病毒有治療作用。直接殺傷實驗該方能夠降低病毒滴度1個梯度。在0.005 mg/mL時抗AV1紅細胞凝集實驗為陰性,表明該方能夠抑制AV1。鏡下觀察CPE表明0.01 mg/mL以上濃度的中藥能夠抑制RSV1。

中醫學認識中病毒性呼吸道感染并無特定病名,根據其發病過程、臨床表現應屬于“外感熱病”范疇,國內臨床醫師及研究人員多根據中醫理論,采用防治“熱病”的理法方藥應對新發突發呼吸道傳染病,取得了較好的效果[5-6]。由于中藥含有的活性成分十分復雜,殺滅病毒具有多種機制和多個靶點的特性,在殺滅病毒的同時,還具有免疫調節的作用,從而改善患者的免疫功能[2,10]。本次研究結果說明,外感清熱解毒方在體外抗呼吸道病毒方面,具有較好的療效,為更深一步的體內實驗和臨床治療提供了參考,值得開展更廣闊的研究。

[1]孫婷婷,陳蘭羽,呂文良,等.800例外感發熱患者中醫證候分布及與節氣關系[J].中國中醫急癥,2014,23(9):1622-1623,1641.

[2]楊巨成,張海文.清熱解毒存陰法治療外感發熱的臨床觀察[J].中國民間療法,2014,22(7):31-32.

[3]Rewar S,Mirdha D,Rewar P.Treatment and Prevention of Pandemic H1N1 Influenza[J].Ann glob Health,2015,81(5):645-653.

[4]鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導原則[M].北京:中國醫藥科技出版社,2002.

[5]孫飛,陳曉春,張立國,等.中藥抗流感2號治療甲型流感樣發熱聚集性病例的臨床觀察[J].世界中西醫結合雜志,2014,9(10):1068-1071.

[6]成揚,麥靜愔,薛建華,等.外感清熱解毒方治療急性上呼吸道感染發熱臨床評價[J].上海中醫藥大學學報,2016,30(4):22-25.

[7]Glatthaar-Saalmüller B,Rauchhaus U,Rode S,et al.Antiviral activity in vitro of two preparations of the herbal medicinal product Sinupret? against viruses causing respiratory infections[J].Phytomedicine,2011,19(1):1-7.

[8]Sharma M,Anderson SA,Schoop R,et al.Induction of multiple pro-inflammatory cytokines by respiratory viruses and reversal by standardized Echinacea,a potent antiviral herbal extract[J].Antiviral Res,2009,83(2):165-170.

[9]Kemmerich B.Evaluation of efficacy and tolerability of a fixed combination of dry extracts of thyme herb and primrose root in adults suffering from acute bronchitis with productive cough.A prospective,double-blind,placebo-controlled multicentre clinical trial[J].Arzneimittelforschung,2007,57(9):607-615.

[10]王鎵,董競成.中醫藥防治呼吸道病毒感染研究綜述[J].中國中西醫結合雜志,2014,34(5):633-636.

(2016-04-08收稿 責任編輯：王明)

Effect of Waigan Qingre Jiedu Formula Against Respiratory Virus In Vitro

Hou Tianlu1，2, Zhan Tiantian2,Xi An3,Hu Yixiang3,Cheng Yang1,2,Ping Jian2，Chen Jianjie1,2

(1InfectiousDiseaseHospitalofShanghaiPudongNewArea,Shanghai201299,China; 2ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityoftraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 3ZhongyiHospitalofShanghaiPudongNewArea,Shanghai201299,China; 4ZhejiangAcademyofMedicalSciences,Hangzhou310013,China)

Objective:To study the activity of Waigan Qingre Jiedu decoction against respiratory virus in vitro. Methods:MDCK, HEL and A549 cells were cultured in vitro; influenza virus H1N1, adenovirus AV1 and respiratory synthetic virus RSV1 were inoculated respectively. Waigan Qingre Jiedu decoction was given to intervene, and Ribavirin was given as control. MTT method was used to detect the cytotoxicity of the drug and therapeutic index. Hemagglutination test and Cytopathic effect were used to study the effect against respiratory virus. Results:IC50 of Waigan Qingrejiedu decoction against H1N1 was 0.028 mg/mL. TI was 2.07. In the prevention administration experiment, hemagglutination test at the concentration of 0.01 mg/mL was negative, which indicates that the decoction could block H1N1 virus invasion and has preventive effect. In the therapy administration experiment, hemagglutination test at the concentration of 0.01 mg/mL was negative, which showed that the decoction had a therapeutic effect on the virus. In the Direct killing experiment, the decoction can reduce the virus titer by 1 gradient. Hemagglutination test against AV1 at the concentration of 0.005 mg/mL was negative, which showed that the decoction could inhibit AV1. The observation of Cytopathic effect under the microscope showed that the decoction could inhibit RSV1 in the concentration of 0.01 mg/mL. Conclusion:Waigan Qingre Jiedu decoction has high activity against H1N1, AV1 and RSV1, with the advantage of having high efficiency and low toxicity.

Waigan Qingrejiedu decoction; H1N1 virus; AV1 virus; RSV1; In vitro study

上海市中醫藥三年行動計劃項目(編號:ZY3-JSFC-1-1011);上海市浦東新區中醫藥事業發展專項資金項目(編號:PDYNZJ2014-08);上海市中醫藥領軍人才建設項目-海上名醫傳承學術共同體項目(編號:ZY3-RCPY-1-1001);陳建杰上海市名中醫工作室項目(編號:ZYSNXD-CC-MZY003)

R285

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.042