新活絡效靈丹對ApoE基因敲除早期動脈粥樣硬化小鼠TGF-β的影響

房玉濤 劉桂芳 張 云

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京，100053)

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新活絡效靈丹對ApoE基因敲除早期動脈粥樣硬化小鼠TGF-β的影響

房玉濤 劉桂芳 張 云

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京，100053)

目的：觀察新活絡效靈丹對ApoE基因敲除小鼠AS早期斑塊的病理形態學改變及轉化生長因子-β(TGF-β)表達的影響，探討新活絡效靈丹抗AS早期斑塊的可能機制。方法：采用高脂飼料喂養ApoE基因敲除小鼠建立AS模型，將45只小鼠隨機分為模型組、西藥組、中藥組，另將C57BL/6J小鼠10只設為空白對照組。在造模的同時即給予藥物干預，空白對照組不予處理，模型組予以生理鹽水0.3 mL/d，中藥組給予新活絡效靈丹9.67 g/(kg·d),西藥組給予阿托伐他汀鈣片3.33 mg/(kg·d)，均每日灌胃1次，連續給藥13周。取主動脈根部，HE染色進行病理觀察，采用RT-PCR技術檢測各組TGF-βmRNA的表達水平。結果：模型組主動脈內形成明顯的AS斑塊，并出現脂質核心,泡沫細胞增多，大量的巨噬細胞的浸潤；西藥組管壁可見AS斑塊，斑塊面積明顯小于模型組；中藥組斑塊面積顯著減少，部分內膜較為光滑。模型組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平明顯低于空白對照組(P<0.01)；西藥組、中藥組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平明顯高于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，而中藥組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平高于西藥組，但2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論：新活絡效靈丹在一定程度上可通過上調保護性因子TGF-β以抑制免疫炎性反應，發揮抗動脈粥樣硬化的作用,可能是其防治AS早期斑塊的形成機制之一。

新活絡效靈丹；ApoE基因敲除小鼠；動脈粥樣硬化；轉化生長因子-β

動脈粥樣硬化(Artherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要致病因素，具有進展性和全身性的特點。防治AS的關鍵在于早期干預，防止、延緩斑塊形成和穩定斑塊。在AS發生和發展過程中，炎性反應始終起著重要作用[1-2]。研究表明，轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor Beta，TGF-β)具有抗炎和對抗脂質損害的作用,可延緩AS的發展，是保護心血管系統重要的細胞因子之一[3-4]。本研究通過高脂飲食構建ApoE基因敲除小鼠AS模型，觀察新活絡效靈丹對ApoE基因敲除小鼠AS的早期斑塊面積的影響，并采用PCR技術，檢測主動脈內TGF-β表達水平，從而探討其防治AS斑塊形成的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡ApoE基因敲除小鼠(C57BL/6J)45只，均為雄性，體重17～21 g，飼以高脂飼料；清潔級C57BL/6J小鼠10只，6～8周齡，均為雄性，體重17～21 g，普通飼料喂養。飼養條件為2級，室溫20～24 ℃，相對濕度40%～60%，光照時間：7:00—19:00。以上動物購自北京大學醫學部實驗動物中心，許可證號：SCXK(京)2011-0012。

1.2 實驗藥物及制備 新活絡效靈丹(顆粒劑型)：丹參30 g、三七4 g、乳香12 g、沒藥12 g，由中國中醫科學院廣安門醫院藥劑科制備，顆粒劑為四川新綠色藥業科技發展股份有限公司生產。阿托伐他汀鈣片由大連輝瑞制藥有限公司提供，20 mg/片(批號：031711k)。

1.3 主要試劑和儀器 Trizol試劑，購自Invitrogen公司，批號：14105；Fermentas K1622 RT逆轉錄試劑盒購自MBI公司，批號：00044977；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自美國應用生物公司，批號：1108401；7900HT型熒光定量PCR儀，購自美國應用生物公司；光學顯微鏡，BX-41型，日本OLYMPUS公司；引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，引物序列：上游5′-CCAGATCCTGTCCAAACTAAGG-3′，下游：5′-TTTCTCATAGATGGCGTTGTTG-3′,擴增物長度：217 bp。蘇木素伊紅(HE)染液由廣安門醫院病理實驗室提供。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及造模 適應性喂養4 d后，采用隨機數字表法將45只ApoE基因敲除小鼠分為模型組15只、中藥組15只、西藥組15只。3組均喂以高脂飼料飼料(78.85%基礎飼料+0.15%膽固醇+21%脂肪混合而成)13周。另設C57BL/6J小鼠10只為空白對照組，給予正常飼料喂養。

1.4.2 各組小鼠給藥方法 造模同時即進行藥物干預，根據成人臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體重折算系數10折算成小鼠用量，中藥組給予新活絡效靈丹顆粒劑9.67 g/(kg·d)灌胃，西藥組給予阿托伐他汀鈣片3.33 mg/(kg·d)灌胃。西藥組和中藥組藥劑均以蒸餾水溶解后，按照體重比灌胃；模型組每天給予0.3 mL的生理鹽水灌胃。連續給藥13周。空白對照組小鼠不予處理。

1.5 觀察指標與方法 給藥13周后取材，取材前夜禁食水。處死全部小鼠，無菌條件下取出主動脈根部，部分組織常規石蠟包埋切片，部分組織放在凍存管內液氮驟冷保存。1)自主動脈根部連心肌部分橫斷面做連續切片，切片厚度5 μm[5]。對切片分別行HE染色，在鏡下觀察主動脈病理組織形態。2)RT-PCR法檢測小鼠主動脈中TGF-β mRNA表達，參照試劑盒說明進行操作。

2 結果

2.1 各組小鼠主動脈組織HE染色結果 空白對照組(A):主動脈內膜光滑連續，內皮細胞排列均勻，表面光滑，未見泡沫細胞及炎性細胞；模型組(B)：主動脈內形成明顯的AS斑塊，并可出現脂質核心，膽固醇和膽固醇酯沉積，泡沫細胞增多，大量的巨噬細胞的浸潤；西藥組(C)：管壁可見AS斑塊，斑塊面積明顯小于模型組；中藥組(D)：斑塊面積顯著減少，部分內膜較為光滑。見圖1。

圖1 各組小鼠主動脈根部組織病理圖(HE染色，×15倍)

2.2 各組小鼠主動脈TGF-βmRNA表達比較 表1顯示，模型組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平明顯低于空白對照組(P<0.01);西藥組、中藥組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平明顯高于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，而中藥組小鼠腹主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平高于西藥組，但2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠主動脈組織中TGF-β mRNA

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

目前已有很多研究證據表明，AS是一種血管的慢性炎性反應病變。炎性反應可以啟動斑塊內炎性細胞分泌多種細胞因子，通過多種途徑影響斑塊穩定。抑制血管的炎性反應已成為除他汀之外的另一重要的抗AS手段。

TGF-β是一類功能廣泛、作用復雜的生長因子，參與炎性反應、創傷修復和免疫調節、細胞生長和分化、細胞外基質合成等許多生物學過程[6]。研究表明，TGF-β具有抗炎和對抗脂質損害的作用,可延緩AS的發展，是保護心血管系統重要的細胞因子之一[7-8]。近來發現不穩定性心絞痛的患者呈現TGF-β水平下降的趨勢，低水平的TGF-β表達很可能與AS的進展密切相關[9-10]。

血瘀證貫穿AS整個病變過程的觀點已經得到眾多醫者認同，臨床采用活血化瘀為主治療AS，療效得到確定。挖掘組方簡潔、療效確切、機制明確、價格低廉、易于久服的抗AS活血化瘀方劑有著非常重要的現實意義。

活絡效靈丹為近代名醫張錫純所創，首見于《醫學衷中參西錄》，近年，運用該方加減在心血管疾病領域的作用日益受到重視和關注[11]。我們根據多年臨床經驗，將活絡效靈丹加減，化裁創制出新活絡效靈丹(乳香、沒藥、三七、丹參)，治療AS取得較好療效。乳香、沒藥為樹脂類活血化瘀中藥，兩者均具有活血化瘀、消腫止痛生肌之效，現代藥理研究表明：乳香具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理活性，抗炎作用可能與其對炎性反應細胞因子的調控和對蛋白激酶通路的影響有關[12]。沒藥具有強效抑制急慢性炎性反應的作用，其活性成分能降低炎性反應遞質過氧化物酶的活性[13]。方中以三七易當歸，活血止血、生血補氣，以糾乳香、沒藥久服耗氣之弊，使祛瘀而不傷正，易于長久服用。現代藥理研究表明[14]，三七能通過抑制血小板聚集、促進纖溶而達到抗血栓的效應。其有效成分三七總皂苷提高心肌對缺氧環境的耐受力，同時擴張血管、改善血供。丹參具有祛瘀止痛、活血通經之功。現代藥理研究表明[15]，丹參可擴張冠狀動脈、降低心肌耗氧量、防止心肌缺血和心肌梗死，所含丹參酮可抑制炎性反應細胞活化、降低炎性反應細胞因子、趨化因子表達。四藥相伍，共奏補氣活血、化瘀通經之效，臨床治療AS療效顯著，但是其作用機制尚不明確。

本研究顯示，與模型組比較，中醫組和西藥組AS斑塊面積明顯縮小，證實新活絡效靈丹具有防止AS早期斑塊形成的作用，中藥組AS小鼠主動脈組織TGF-B mRNA表達明顯升高，與西藥組比較無明顯差異，提示新活絡效靈丹具有提高AS小鼠主動脈組織TGF-βmRNA的表達的作用，可能是防治AS早期斑塊形成的機制之一。

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(2016-08-22收稿 責任編輯：洪志強)

Effect of New Huoluo Xiaoling Dan on the TGF-β in ApoE Knock-out Mice with Early Atherosclerosis

Fang Yutao, Liu Guifang，Zhang Yun

(Guang′anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalsciences,Beijing100053,China)

Objective:To observe the effect of New Huoluo Xiaoling Dan (NHLXLD)on aorta pathological changes in ApoE Knock-out mice and the expressions of Transforming Growth Factor beta (TGF-β),and to explore possible mechanism of anti-AS．Methods:AS model was induced by high lipid diet in ApoE knock-out mice.Forty five ApoE knock-out mice were equally randomized into 3 groups， including control group(CG),western medicine group (WMG) and traditional Chinese medicine group(TCMG).Ten C57BL /6J mice were also prepared as blank group (BG).During modeling,BG received no intervention;CG took normal saline 0.3 mL daily;TCMG was treated by NHLXLD 9.67 g/kg.d,and WMG was administered avarstatin 3.33 mg/kg.d.The treatment lasted for 13 weeks with gastric lavage once everyday.Then the aortic roots were taken for HE stain and the mRNA levels of TGF-βof each group were assayed．Results:Atherosclerotic plaques were observed obviously in the aorta of CG mice with overwhelming formation of foam cells, lipid core and a large number of macrophages infiltration．There were visible AS plaques on WMG aortic wall;plaque area was significantly lower than the CG;plaque area in TCMG was significantly reduced with the more smooth aortic endometrium. The TGF-β mRNA expressions of CG were lower than BG(P<0.01);The TGF-β mRNA expressions of WMG and TCMG were higher than CG(P<0.05 orP<0.01).While the TGF-β mRNA expressions of TCMG were higher than WMG, but the difference was not statistically significant (P>0.05).Conclusion:NHLXLD suppressed immune inflammatory response in a certain extent by increasing protective factor TGF-β on anti-AS.It might be one of the possible mechanisms preventing the formation of AS plaque．

New Huoluo Xiaoling Dan; ApoE Knock-out Mice;Atherosclerosis; TGF-β

中國博士后科學基金(編號：20080440498)；國家自然科學基金青年項目(編號：81302964/H2708)

R972.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.044