丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對大鼠急性心肌缺血預處理VEGF的影響

李小燕 杜成芬 肖 敏 夏俊琳 趙 娟 何華瓊

(1 湖北省十堰市太和醫院急診科，十堰，442000； 2 湖北醫藥學院機能實驗室，十堰，442000)

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丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對大鼠急性心肌缺血預處理VEGF的影響

李小燕1杜成芬1肖 敏1夏俊琳1趙 娟1何華瓊2

(1 湖北省十堰市太和醫院急診科，十堰，442000； 2 湖北醫藥學院機能實驗室，十堰，442000)

目的：觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對大鼠急性心肌缺血/再灌注損傷缺血預處理后血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)表達的影響。方法：16只健康大鼠隨機分為缺血/再灌注組、丹參酮預處理組，丹參酮預處理組經尾靜脈注射1%丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，缺血/再灌注組給予等體積生理鹽水預處理。于預處理14 d后采用結扎左側冠狀動脈前降支30 min再復灌30 min的方法建立大鼠急性心肌缺血/再灌注損傷模型。檢測缺血預處理前后靜脈血超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性及缺血心肌組織丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，心肌缺血區組織VEGF及VEGF-mRNA、缺氧誘導因子-1a(Hypoxia Inducible Factor-1a，HIF-1a)及HIF-1a mRNA、受體胎肝激酶-1(Fetal Liver Kinase 1，FLK-1)及FLK-1mRNA表達。結果：與缺血/再灌注組比較，丹參酮預處理組VEGF及VEGF-mRNA、FLK-1、FLK-1mRNA、HIF-1a、HIF-1amRNA的表達均明顯增強，SOD及CAT活性明顯提高，MDA降低(P<0.05)。結論：丹參酮ⅡA磺酸鈉預處理可提高VEGF表達及超氧化物歧化酶活性，對急性心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌有一定的保護作用。

丹參酮ⅡA磺酸鈉；急性心肌缺血預處理；血管內皮生長因子

VEGF具有增加微、小靜脈血管的通透性、促使血管內皮細胞分裂增殖及誘導血管生成再生等作用[1]。在心肌缺血再灌注中，VEGF作為一種高度特異性的促血管生長因子也因缺血刺激而出現增高以彌補心肌缺血缺氧。由于VEGF具有促進血管內皮細胞增殖遷移再生、誘導多種血管活性物質合成并參與缺血心臟冠狀動脈側支循環形成的作用，故VEGF在臨床上常作為血管內皮功能的重要指標之一[2]。而急性心肌梗死(Cute Myocrdil Infrction，MI)是在冠狀動脈病變如粥樣硬化、梗阻的病理基礎上導致冠狀動脈血供急劇減少或中斷，使缺血區心肌嚴重而持久地急性缺血[3]。近年來的流行病學統計數據表明我國MI發病率呈升高趨勢[4]。急性心肌梗死、冠脈溶栓術、冠脈搭橋術、心肌梗死再通術等疾病和手術常引起急性心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷[5]。在發生心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷前及時的進行干預(即缺血預處理)以減輕心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷顯得尤其重要。近年來心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷的防治已取得了明確的成果，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可提高心肌細胞耐缺氧能力，增強心肌收縮力，擴張冠狀動脈進而改善心臟功能,預防和治療血管再狹窄及缺血心肌保護等作用[6]。為探討丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對急性心肌缺血再灌注損傷預處理后VEGF表達及心肌酶譜等的影響，我們建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，采用丹參酮ⅡA磺酸鈉對大鼠進行缺血預處理來研究其作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康Wistar大鼠16只，鼠齡(50±5)d，體質量(180±50)g，采用隨機數字表編號隨機分隨機分為缺血/再灌注組、丹參酮預處理組，每組8只(n=8)。實驗動物由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，實驗動物設施使用許可證SYXK(鄂)2011-0031，實驗動物生產許可證SCXK(鄂)2011-0008。動物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照，分籠飼養，自由飲水，普通飼料喂養，每日觀察動物進食情況，稱體重，及時清理糞便，本研究中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.2 儀器及試藥 MDA、CAT、SOD測試盒(廠家：上海江萊生物科技有限公司，批號：KB13297)，大鼠VEGF共調節趨化因子1(VCC1)ELISA試劑盒(廠家：上海酶聯生物科技有限公司，產品貨號：028457)。提取mRNA試劑及反轉錄試劑(美國Invitrogen公司)。丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液粉(杭州正大青春寶藥業有限公司，10 mg/瓶，國藥準字GR0532)，使用前用蒸餾水配制成1%溶液并保存于4 ℃冰箱備用。

1.3 缺血預處理方法 丹參酮預處理組大鼠在制備急性心肌缺血動物模型前14 d經尾靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液2 mL/100 g/d，按此劑量連續預處理14 d，缺血/再灌注組注射等量生理鹽水。

1.4 急性心肌缺血動物模型制備 在經缺血預處理14 d后，參照文獻[7]，所有動物在造模前夜停止喂食，不禁水，手套法抓取大鼠，碘伏消毒局部皮膚腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)麻醉、腹部向上固定，接Ⅱ導聯以記錄Ⅱ導聯心電圖(EEG)，接小動物呼吸機并調整潮氣量使麻醉大鼠呼吸與之同步，于(5-6)肋間用手術刀開胸，剪開心包暴露心臟，用玻璃分針向右輕輕按壓心臟，充分暴露冠狀動脈前降支，用微創園縫合針自肺動脈圓錐進針、從左心房邊緣后外測出針，于縫合線與心臟前降支表面置一軟管，然后拉緊縫合線結扎左側冠狀動脈前降支30 min再復灌30 min，并反復3次阻斷與再灌注的方法建立大鼠急性心肌梗死動物模型。此時心電圖會立刻出現新的Q波并有ST段抬高、T波高聳或倒置等EEG改變，大鼠術后存活1 d以上就可判斷為造模型成功。

1.5 檢測指標 參照文獻[8]，分別于缺血預處理前后經大鼠眼眶靜脈采血，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定SOD、CAT活性。參照文獻[9]，在缺血預處理前及缺血預處理14 d后，3組動物取血完畢后用手術剪斷頭處死動物，剪下心臟,取左心室部位心肌缺血區組織，暫存至-30 ℃低溫冰箱保存待測，以備VEGF蛋白分析。檢測時取心肌缺血區組織標本研磨，以3 000 r/min高速離心(離心半徑70 mm)取上清液，嚴格按SP試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心EUSA法測定心肌缺血區組織FLK-1及FLK-1mRNA、HIF-1a及HIF-1amRNA、VEGF蛋白質及mRNA的表達；采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)嚴格按試劑盒說明檢測心肌缺血區MDA含量。

2 結果

2.1 大鼠SOD、MDA、CAT水平比較 缺血/再灌注組心肌缺血區MDA增高，血清SOD、CAT水平明顯降低，與本組預處理前比較(P<0.05),差異有統計學意義。在缺血預處理14 d后丹參酮預處理組MDA降低、SOD、CAT含量明顯增高，與缺血/再灌注組及本組預處理前比較(P<0.05),差異有統計學意義，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液具有促進SOD、CAT的釋放，增強組織對自由基清除活性酶，抑制脂質過氧化反應的作用。見表1。

2.2 大鼠缺血區VEGF、VEGFmRNA表達比較 缺血/再灌注組在造模后VEGF、VEGFmRNA表達均有增強趨勢，與本組預處理前比較(P<0.05)，差異有統計學意義，提示缺血、缺氧可促進VEGF分泌。丹參酮預處理組在缺血預處理14 d后VEGF、VEGFmRNA表達明顯增強，且明顯高于缺血/再灌注組，與本組預處理前及缺血/再灌注組比較(P<0.05)，差異有統計學意義。見表2。

2.3 大鼠HIF-l、HIF-lamRNA表達比較 在缺血預處理14 d后，缺血/再灌注組HIF-l、HIF-lamRNA表達呈升高趨勢，與本組預處理前比較(P>0.05)。丹參酮預處理組HIF-la、HIF-lamRNA比缺血/再灌注組增加更為明顯，與本組預處理前及缺血/再灌注組比較(P<0.05),差異有統計學意義。見表3。

2.4 大鼠FLK-1、FLK-1mRNA表達比較 缺血/再灌注組在缺血預處理14 d后，FLK-1、FLK-1mRNA表達無明顯變化,與本組預處理前比較(P>0.05)，丹參酮預處理組FLK-1、FLK-1mRNA陽性表達均明顯增強，與本組預處理前及缺血/再灌注組比較(P<0.05),差異有統計學意義。見表4。

表1 大鼠SOD、MDA、CAT水平比較

注：與本組預處理前比較，aP<0.05；與缺血/再灌注組比較,bP<0.05。

組別時間VEGF(Pg/mL)VEGFmRNA缺血再灌注組預處理前55.47±4.220.52±0.07預處理14d88.90±7.39a0.86±0.17a丹參酮預處理組預處理前56.50±5.870.54±0.08預處理14d110.37±9.12ab1.84±0.24ab

注：與本組預處理前比較，aP<0.05；與缺血/再灌注組比較,bP<0.05。

表3 大鼠缺血預處理HIF-l、HIF-lamRNA陽性表達比較

注：與本組預處理前比較，aP<0.05；與缺血/再灌注組比較,bP<0.05。

表4 大鼠缺血預處理FLK-1、FLK-1mRNA表達比較

注：與本組預處理前比較，aP<0.05；與缺血/再灌注組比較，bP<0.05。

3 討論

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液是從中草藥丹參塊莖中純化分離出的二萜醌類化合物經磺化反應而制成的滅菌注射液，主要藥理成份有丹參酮甲酯、丹參酚酸及丹參酮ⅡA等[10-11]。中醫典籍《吳普本草》中記載其味辛性涼、具涼血消癰、活血通經之功效[12]，主治心肌腹痛[13]。現代醫學亦證實其中的丹參素及丹參酮ⅡA具有擴張心肌血管、增加缺血心肌組織血液流量，抑制缺血區組織細胞內鈣超載而發揮心肌保護作用[14]。

在本實驗中，丹參酮預處理組HIF-1a及HIF-1amRNA、VEGF蛋白及mRNA、FLK-1及FLK-1mRNA的陽性表達明顯增強，這可能與丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液誘導缺血急性心肌的血管再生、擴張冠狀動脈而改善微循環、增加冠脈灌注血流量，保證急性缺血心肌血液供應、活血化瘀的藥性特征有關，另一方面也可能與其促進Ca2+-ATP酶活性恢復,增強鈉鉀ATP酶活力,減少細胞內鈣超載,并通過鈉鉀ATP酶調節鈉氫交換來抑制鈉鈣交換,阻止Ca2+內流,改善急性心肌組織能量代謝，進而改善急性心肌缺血而起到保護作用有關。由于機體代謝過程中產生有害過氧化氫等代謝產物，在發生脂質過氧化反應時對機體組織器官造成嚴重損害，而CAT是細胞催化過氧化氫分解成氧和水的酶，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受過氧化氫的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一[15]。實驗觀察到，丹參酮預處理組MAD明顯降低，SOD、CAT酶活性增強，說明丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可增強SOD及CAT等自由基清除活性酶的活性[16-17]，抑制有害代謝產物過氧化氫造成的脂質過氧化反應，改善急性心肌組織的能量代謝，改善病灶缺血、水腫，促進細胞功能恢復，減輕缺血再灌注后組織損傷而起到急性心肌缺血/再灌注損傷保護作用。

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(2015-11-09收稿 責任編輯：張文婷)

Effect of Sodium SulfonateⅡ A Sulfonate Injection on VEGF of Rats with Acute Myocardial Ischemia Preconditioning

Li Xiaoyan1，Du Chengfen1，Xiao Min1，Xia Junlin1，Zhao Juan1，He Huaqiong2

(1Departmentofemergency，HubeiShiyanTaiheHospitalAffiliatedHospitaltoHubeiMedicalCollege，Shiyan442000，China； 2HubeiMedicalCollege，Shiyan442000，China)

Objective:To observe the effect of sodium sulfonate A sulfonate injection on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in rats with acute myocardial ischemia / reperfusion injury.Methods:Sixteen healthy rats were randomly divided into two groups，ischemia / reperfusion group and Salvia miltiorrhiza group.The two rats were treated with 1% sodium sulfonateⅡ A sulfonate injection and sodium chloride injection from caudal vein.After fourteen days，rats underwent a 30 min left anterior descending coronary artery occlusion and a 30 min reperfusion.This process was repeated 3 times.Mycardial tissue and serum were assessed by Western blot，quantitative RT-PCR and assay kit.Results:The expression of FLK-1，FLK-1mRNA，HIF-1a，HIF-1amRNA，VEGF and VEGF-mRNA were increased.The activity of SOD and CAT were significantly enhanced，however the content of MDA was decreased compared with IR.The difference showed statistically significant(P<0.05).Conclusion:Sodium Sulfonate A Sulfonate may enhance the expression of VEGF and the activity of SOD.It has certain protective effects on rats with acute myocardial ischemia / reperfusion injury.

Sodium Sulfonate A Sulfonate； Acute myocardial ischemia preconditioning； Vascular endothelial growth factor

十堰市科技局項目(編號：ZD2013013)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.046