自身免疫性肝炎患者肝組織程序性細胞死亡因子1及其配體1的表達及其與臨床的相關性

柯坤宇 魏大海 陳麗芳 孔金峰 孫芳 熊克宮

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·論 著·

自身免疫性肝炎患者肝組織程序性細胞死亡因子1及其配體1的表達及其與臨床的相關性

柯坤宇 魏大海 陳麗芳 孔金峰 孫芳 熊克宮

目的 通過檢測程序性細胞死亡因子1(PD-1)及其配體1(PD-L1)在自身免疫性肝炎(AIH))患者不同分期肝組織中的表達情況，探討其在AIH發病機制中的作用。方法 收集43例AIH患者(包括活動期31例和緩解期12例)肝組織，并選擇9例健康者為對照組。應用免疫組織化學方法結合圖像定量分析系統檢測肝組織內PD-1及PD-L1的表達情況，并比較不同病情分期PD-1及PD-L1表達的差異。結果 AIH患者肝組織PD-1為(10.12±5.31)%，高于對照組(1.74±0.37)%，(P<0.05)，AIH活動期肝組織PD-1為(15.68±6.31)%，高于緩解期(6.24±3.25)%，(P<0.05)。AIH患者肝組織PD-L1為(7.45±4.29)%，高于對照組(1.48±0.32)%，(P<0.05)；AIH活動期肝組織PD-L1為(9.47±4.67)%，高于緩解期(4.78±2.43)%(均P<0.05)。結論 PD-1及其配體PD-L1在AIH患者肝組織中高表達，提示其可能參與了AIH的發病機制。

AIH；PD-1；PD-L1；肝組織；免疫組織化學

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一種病因和發病機制尚未完全明確的慢性進行性肝臟炎性疾病。多項證據表明，遺傳易感性、分子模型學說、自身反應性T細胞、調節性T細胞缺陷參與了自身免疫性肝損傷[1]。程序性細胞死亡因子1 (programmed cell death-l，PD-1)是CD28家族中新發現的傳導抑制信號的共刺激分子，與其配體(主要是PD-L1)具有負性免疫調節作用，主要功能是調節T細胞的活化及分化[2]。PD-1/PD-L1通路可以誘導和維持外周組織的免疫耐受，對防止組織的過度炎性反應以及自身免疫性疾病的發生具有積極作用，但其在AIH中的研究少有報道，且多局限于外周血PD-1及PD-L1，而肝臟是AIH免疫反應的靶器官，因此，本研究通過檢測AIH患者肝組織中PD-1及PD-L1表達情況，探討其在AIH發生、發展中的作用，為AIH的免疫損傷及發病機制研究提供新的理論依據。

資料和方法

一、一般資料

選取2013年1月至2015年8月在福州市傳染病醫院就診的AIH患者43例，男4例，女39例，其中12例在免疫抑制劑治療后達到緩解，其余31例處于發病期未行免疫抑制劑治療。入選病例均經肝臟活組織檢查并經臨床確診。診斷標準參考2008年國際免疫性肝炎小組(IAIHG)提出的AIH 簡化診斷積分系統及2010年美國肝病學會(AASLD)更新的有關AIH的診斷和治療指南[3-4]。排除肝炎病毒感染、藥物性、酒精性和遺傳代謝性肝病等。激素治療前評分≥15分明確診斷AIH。緩解是指癥狀消失，血清轉氨酶、膽紅素、IgG正常，肝組織正常或無活動性肝硬化[5]。對照組取材來自手術切除肝血管瘤病灶附帶的正常周圍肝組織，均取得患者同意并簽署知情同意書。3組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

二、標本收集及實驗方法

(一)肝組織標本采集和處理 患者均于入院病情穩定后在超聲引導下，采用巴德BARD一次性全自動活檢槍(購自美國巴德公司，型號MN1620)。肝組織標本長度2.0 cm左右，匯管區數≥8個，4%甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋、切片，HE染色。光學顯微鏡多視野觀察。肝組織均由兩名有經驗的病理科醫生獨立閱片。PD-1及表達水平檢測采用免疫組織化學卵白素-生物素-酶復合物染色法(ABC)，PD-l抗體(購自美國R&D公司)，為山羊抗人多克隆抗體；PD-L1抗體(購自美國life spanbiosciences公司)，為兔抗人多克隆抗體，按試劑盒說明書進行。免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

(二)肝組織PD-1/PD-L1表達的檢測和判定 采用ABC法檢測PD-1及PD-L1，表達的工作濃度為1∶200，切片厚度4 μm，3%H2O2作用5 min去除內源性過氧化物酶，分別加入兔抗人PD-1多克隆抗體，4 ℃過夜，次晨分別加二抗，DAB顯色，蘇木精復染。PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定：陽性結果呈棕黃色顆粒，位于肝細胞胞膜(或)及胞質，胞核呈淺藍色。

(三)圖像分析及定量方法 每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)，應用HPIAS 1000圖像分析儀，檢測肝組織PD-1/PD-L1蛋白表達的平均吸光度值(MOD)與積分吸光度值(IOD)，以每例5個視野的平均值作為測量值。

三、統計學處理

計量資料以均數±標準差表示，正態分布的兩組組間比較采用t檢驗；非正態分布的兩組組間比較采用秩和檢驗；方差齊則對多樣本資料采用單因素方差分析及LSD-t檢驗比較組間差異，方差不齊則采用Mann-WhitneyU檢驗比較組間差異，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、研究對象的一般情況

43例AIH患者，其中31例為活動期患者，男性3例，女性28例，平均年齡(47.2±12.4) 歲；12例為免疫抑制劑治療后緩解期患者，男1例、女11例，平均年齡(48.6±11.8) 歲。活動期患者表現為肝功能不同程度異常、IgG水平增高，外周血出現多種自身抗體陽性，緩解期AIH患者肝功能及IgG水平均恢復正常，但外周血中自身抗體陽性比例與活動期相似，且滴度較活動期無明顯變化(見表1、表2)。

表1 AIH患者肝功能及免疫球蛋白檢測結果

TBil：總膽紅素；DBil：直接膽紅素；ALT：丙氨酸轉氨酶；AST：天冬氨酸轉氨酶；GGT：谷氨酰轉肽酶；ALP：堿性磷酸酶；GLO：球蛋白；IgG：免疫球蛋白G；IgA：免疫球蛋白A；IgM：免疫球蛋白M

表2 AIH患者自身免疫抗體檢測結果

ANA：抗核抗體；AMA：抗線粒體抗體；SMA：抗平滑肌抗體；抗SLA/LP：抗可溶肝抗原/肝胰抗體

二、AIH患者肝臟組織病理學改變

AIH以肝實質損傷為主要表現，31例活動期AIH患者以界面性肝炎和匯管區淋巴細胞、漿細胞及單核細胞等炎性細胞浸潤為主，且大部分肝小葉內可見點狀或碎屑樣壞死，多數不累及膽管。界面性肝炎29例(93.5% )，淋巴、漿細胞浸潤27例(87.1% )，膽管破壞性炎癥2例(6.45% )(見圖1)。12例緩解期患者匯管區及小葉間隔周圍肝細胞均無明顯壞死，無或僅有少量淋巴細胞浸潤，無界面性炎，亦未見橋接壞死。此外，幾乎所有AIH都存在不同程度的纖維化，嚴重病例可出現肝硬化。

三、PD-1在肝組織中的表達情況

肝組織切片中PD-1主要表達于淋巴細胞(包括T細胞、少量漿細胞)及一些庫普弗細胞的胞質內，不同炎癥及纖維化程度的肝組織中PD-1陽性表達細胞的分布較一致，主要分布在炎性細胞浸潤的匯管區及壞死區，以匯管區淋巴細胞浸潤較多處較為顯著，肝細胞中未見表達。PD-1在對照組中無表達或極弱陽性表達(見圖2～4)。定量圖像分析結果顯示AIH患者肝組織PD-1為(10.12±5.31)%，高于對照組(1.74±0.37)%(P<0.05)；AIH活動期肝組織PD-1為(15.68±6.31)%，高于緩解期(6.24±3.25)%，(P<0.05)。

四、PD-L1在肝組織中的表達情況

所有43例AIH患者的PD-L1在肝組織炎性細胞浸潤較明顯的區域部分肝細胞胞膜及胞質均有著色。AIH活動期患者在肝組織匯管區、小葉肝竇內沿肝細胞竇側及炎性壞死區可見到較明顯PD-L1表達，常伴有淋巴細胞包繞及密切接觸，并沿肝板在肝竇壁、壞死灶呈放射狀分布，炎性細胞浸潤較明顯的區域部分肝細胞胞質亦有著色，陽性細胞數明顯增加；治療后緩解組肝組織可見少量PD-L1表達，陽性細胞散在分布，可表達于匯管區，同時在小葉肝竇內沿肝細胞竇側及炎性壞死區有少量表達。PD-L1在對照組中無表達或極弱陽性表達(見圖5～7)。定量圖像分析結果顯示AIH患者肝組織PD-L1為(7.45±4.29)%，高于對照組(1.48±0.32)%，(P<0.05)；AIH活動期肝組織PD-L1為(9.47±4.67)%，高于緩解期(4.78±2.43)%(均P<0.05)。

注：圖1為HE染色，×100；圖2～7均為ABC法，×400。圖1 活動期AIH患者肝組織，圖2 PD-1在活動期AIH患者肝組織中的表達，圖3 PD-1在靜止期AIH患者肝組織中的表達，圖4 PD-1在對照組肝組織中的表達，圖5 PD-L1在活動期AIH患者肝組織中的表達，圖6 PD-L1在靜止期AIH患者肝組織中的表達，圖7 PD-L1在對照組肝組織中的表達

討 論

AIH是一種免疫介導的肝損傷，以肝組織內T細胞浸潤、高γ球蛋白血癥、血清自身抗體陽性、具有人類白細胞抗原遺傳背景、常伴發其他自身免疫性疾病和對免疫抑制治療有效為特征[6]。目前盡管AIH的發病機制尚未完全闡明，但已明確自身免疫異常是AIH發病的主要原因。自身免疫異常通常指正常的免疫系統由于某種原因而出現免疫功能紊亂，會導致T細胞介導的包括AIH在內的多種自身免疫異常疾病。

PD-1作為CD28家族分子之一，屬于免疫細胞的抑制性共刺激分子，在免疫反應特別是T細胞免疫反應中具有重要作用。PD-1與其配體PD-L1結合后，通過其胞質尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM基序)傳入抑制信號，在免疫應答中發揮負性調控作用[7]。PD-1/PD-L1通路抑制了免疫應答的初始與效應階段，維持機體的免疫自穩，否則過強的免疫應答將導致自身免疫性疾病的發生[9]。在許多自身免疫病動物模型如實驗性自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性糖尿病等動物，阻斷PD-1/PD-L1通路則加速疾病的嚴重程度及進展。PD-1基因敲除的小鼠出生3 d后給予切除胸腺，小鼠可發展為自身免疫性肝炎[8-9]，且在自身免疫性肝炎動物模型中，肝組織內PD-1的mRNA與蛋白含量表達增高[10-11]。在肝組織內PD-L1可表達于肝細胞、竇上皮細胞及庫普弗細胞上，對活化T細胞的增殖和分裂有抑制作用，在活化的T細胞或者在病毒感染期，PD-L1的表達能力升高，表達于肝細胞上的PD-L1與表達于T細胞上的PD-1結合能誘導T細胞的凋亡[12]。PD-L1基因敲除小鼠的CD8+T細胞大量聚集在肝內，活化T細胞在肝內的清除率下降，AIH的發病率上升[13]。

本研究證實，AIH患者肝組織病理學特征為肝實質破壞的界面性肝炎，提示存在針對匯管區肝界板及周圍肝細胞的特異性免疫攻擊。本研究還發現AIH患者肝組織內的所有匯管區均有明顯淋巴細胞浸潤，進一步驗證了AIH患者肝組織發生主要由T淋巴細胞介導的免疫反應，從而導致了持續的肝細胞炎性損傷[14]。同時，本研究表明PD-1在活動期AIH患者表達增高，間接反映了肝內浸潤性T淋巴細胞已被激活，發揮生物學功能。此外，在活動期AIH患者PD-L1的表達水平亦升高，表明其與PD-1結合可抑制T細胞的活化，調控肝臟浸潤效應性T細胞的功能，阻止過度的免疫反應，從而部分程度上避免了自身反應性T細胞對肝臟的破壞作用。研究還發現PD-1/PD-L1的相互作用雖然可以起到自身免疫反饋抑制作用，但由于表達PD-L1的肝組織細胞數量較少，PD-L1的升高并不與PD-1平行。由此推測，PD-1/PD-L1通路并不能有效控制活化T細胞增殖分化的速度與強度，肝臟中PD-1/PD-L1通路調控失常，最終導致了AIH的發展。如果有藥物或其他細胞、分子等物質上調PD-L1的表達，促進PD-1與PD-L1的相互作用，達到一定程度后，可能會加速活化的T細胞凋亡，從而起到治療AIH的作用。因此，對PD-1/PD-L1通路的干預可能為治療自身免疫性肝炎提供一種新的思路。

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(本文編輯：錢燕)

Expressions of PD and PD-L 1 in liver tissues of patients with autoimmune hepatitis and their clinic correlation

KEKun-yu,WEIDa-hai,CHENLi-fang,KONGJin-feng,SUNFang,XIONGKe-gong.

Departmentofliver,TheinfectiousdiseasehospitalofFujianmedicaluniversity,Fuzhou350012,China

Correspondingauthor:XIONGKe-gong,Emal: 510768115@qq.com

Objective To investigate the expressions of programmed death 1 (PD-1) and programmed death ligand 1 (PD-L1) in hepatic tissues of patients with autoimmune hepatitis (AIH), and to explore their roles in the pathogenesis of AIH. Methods The expressions of PD-1 and PD-L1 in hepatic tissues from 43 AIH patients and 9 healthy controls were detected by immunohistochemistry combined with computer image quantitative analysis. Results The PD-1 and PD-L1 expressions in hepatic tissues of AIH patients were 10.12±5.31% and 7.45±4.29%, respectively, which were significantly higher than those in controls (1.74±0.37% and 1.48±0.32%, respectively). The expressions of PD-1 and PD-L1 in hepatic tissues of AIH patients at active stage were 15.68±6.31% and 7.45±4.29%, respectively, which were higher than those in AIH patients in remission (6.24±3.25% and 4.78±2.43%, respectively) and healthy controls (1.74±0.37% and 1.48±0.32%, respectively). Conclusion PD-1 and PD-L1 are overexpressed in hepatic tissues of AIH patients, which reveals that PD-1 and its ligand might play an important role in the pathogenesis of AIH.

AIH; PD-1; PD-L1; Liver tissues; Immunohistochemistry

福州市衛生系統科技計劃項目(2014-S-w21)

350025 福州 福州市傳染病醫院(福建醫科大學附屬傳染病醫院)肝病區

熊克宮，Email:510768115@qq.com

2016-06-28)