血府逐瘀膠囊對模擬失重下骨骼肌萎縮的防護作用

張 淑，袁 明，吳士文

血府逐瘀膠囊對模擬失重下骨骼肌萎縮的防護作用

張 淑1，袁 明2，吳士文1

目的 探討血府逐瘀膠囊在模擬失重狀態下對骨骼肌萎縮的防護作用。方法 建立尾部懸吊大鼠模擬失重模型，30只同源同窩雄性SD大鼠隨機分為對照組、尾吊組和血府逐瘀組（尾吊+血府逐瘀膠囊），每組10只。對照組正常飼養，尾吊組和血府逐瘀組均尾吊30 d。對照組及尾吊組單給予純溶媒，血府逐瘀組給予血府逐瘀膠囊，劑量為25 mg/（kg·d），每組8:00灌胃，1次/d。（1）測量比目魚肌濕重體質量比和橫截面積。（2）應用免疫蛋白質印跡法（Western-blot）技術檢測PI3K/AKT通路相關蛋白及下游分子GRP78、BAX、Cyto-c蛋白表達水平。（3）應用caspase-3 活性檢測試劑盒檢測caspase-3活性。結果 30只大鼠全部進入結果分析，無脫失。（1）與對照組相比，尾吊組比目魚肌平均濕重體質量比下降了56.39%；血府逐瘀組平均濕重體質量比較單純尾吊組增加了14.49%，且差異均有統計學意義（P＜0.05）。（2）尾吊30 d顯著抑制了PI3K/AKT信號通路中PI3K、p-AKT的蛋白表達水平，與對照組比較，血府逐瘀組干預后提高了PI3K、p-AKT的表達，其中對關鍵蛋白p-AKT的表達影響最大，與尾吊組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。（3）尾吊30 d比目魚肌caspase-3酶活性顯著增強，血府逐瘀組caspase-3酶活性較尾吊組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 （1）尾吊模擬失重可通過抑制PI3K/AKT通路相關蛋白表達水平，增強caspase-3酶活性，導致比目魚肌萎縮；（2）血府逐瘀膠囊可能通過提高PI3K/AKT通路相關蛋白表達水平，對失重性肌萎縮起到保護作用。

失重；肌萎縮；血府逐瘀膠囊；PI3K/AKT

航天失重環境下，宇航員的身體機能會發生一系列病理變化，失重或模擬失重可引起骨骼肌（特別是抗重力肌）萎縮，進而導致肌肉收縮力降低、易疲勞性增加，嚴重限制了人類航天事業的發展[1]。失重性肌萎縮

的發生機制目前仍不清楚，失重條件下骨骼肌的萎縮是一個多因素相互作用的結果，臨床表現復雜，發病機理涉及面廣，治療較為困難，缺少有效的防護措施。目前，主要的對抗措施有運動及功能訓練、物理及藥物治療等，但各種防治措施效果并不十分理想。中藥因資源豐富、價格便宜、容易獲得、毒副作用小而可能成為肌萎縮干預研究的一個重要方向。有研究通過模擬失重家兔模型中骨骼肌血液循環的變化提出“血瘀癥”概念，指出可以用活血化瘀類藥物改善萎縮肌肉的血供來對抗，并已取得了一定的效果[2]。因此本研究以尾部懸吊的方法模擬失重模型，選用血府逐瘀膠囊，觀察其是否可以對抗失重狀態下骨骼肌的萎縮，分析其可能作用機制，探討失重狀態下骨骼肌萎縮的有效干預藥物。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，30只，同源同窩，體重200～250 g，平均（236±12）g，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，北京維通利華實驗動物中心提供動物（合格證號：2011A003）。將30只大鼠按10只/組隨機分為對照組、尾吊組和血府逐瘀組（尾吊+血府逐瘀膠囊）。對照組大鼠單籠正常飼養，尾吊組和血府逐瘀組采用尾部懸吊，單籠飼養，身體長軸與水平面呈30°，后肢懸空，前肢著地，可自由進水進食[3]，懸吊30 d。對照組及尾吊組單給予純溶媒，血府逐瘀組給予血府逐瘀膠囊，血府逐瘀組在尾吊過程中每日8：00按體重25 mg/（kg·d）灌胃給藥。動物房室溫保持在 20～25 ℃，人工控制照明，保持 12 h黑暗與12 h光照交替。

1.2 主要試劑及藥物 一抗：PI3K、AKT、p-AKT（Ser473/Thr308）、GRP78、BAX、Cyt-c；二抗：辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、兔抗鼠IgG。所有抗體均購自Cell Signal Technology公司。血府逐瘀膠囊（天津宏仁堂藥業有限公司，國藥準字Z12020223）按25 mg/（kg·d）劑量蒸餾水配置。

1.3 樣品制備 所有大鼠30 d后行3%戊巴比妥那45 mg/kg腹腔麻醉，稱重并記錄。經腹中線逐層開腹，腹主動脈取血，然后迅速取出雙側比目魚肌，電子天平稱重并記錄。取右后肢近中段約15 mm植入黃耆樹膠粉所制固定托上，經異戊烷過渡，存放于液氮中，冰凍切片10 μm/張。

1.4 蘇木精—伊紅染色法 （hematoxylin-eosin staining，HE） 冰凍切片10 μm/張，蘇木精素染色10 min，蒸餾水沖洗—伊紅染色2 min—常規乙醇梯度脫水—二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 免疫蛋白質印跡法（Western-blot）檢測 從液氮凍存管中取出凍存的比目魚肌約50 mg，盡可能用剪刀剪碎，轉移至玻璃勻漿器中，加入提取溶液A（0.22 M甘露醇，0.07 M蔗糖，2 mM Tris，1 mM EDTA，20 mM Hepes，pH 7.2，0.4%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）200 μl，并加入100×磷酸酶抑制劑、100×cocktail、100 mM×苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）各2 μl，勻漿20～30次（PMSF為異丙醇配置，勻漿前臨時加入，所有操作均在冰上進行），600 g離心90 s；收集上清，沉淀重懸，再次勻漿離心。收集合并兩次上清，17 000 g 、4 ℃、15 min離心，留取上清液為胞漿蛋白[4]。采用Thermo公司生產的聚氰基丙烯酸正丁酯（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量分析。上樣前按1∶4加入5×上樣緩沖液（蛋白樣品∶5×上樣緩沖液=4∶1），煮沸5 min，30 μg蛋白樣品上樣，10%SDS-PAGE電泳分離后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。按說明書采用5%脫脂奶粉配置抗體，PI3K 1∶1000；AKT 1∶1000；p-AKT 1∶500； GRP78 1∶1000；BAX 1∶500，分別在4 ℃過夜孵育。第2天取出，采用TBST溶液洗膜5 min ×3次，接著孵育二抗，羊抗兔或羊抗鼠 IgG （1∶2000）室溫孵育1 h；TBST洗膜 10 min×3次，ECL發光，暗室曝光，顯影、定影。將PVDF 膜采用0.2 mol/L NaOH 溶液洗脫后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入 GAPDH抗體（1∶2000）4 ℃過夜孵育，TBST洗膜 5 min×3 次，羊抗兔IgG（ 1∶2000） 室溫孵育1 h，洗膜后再次ECL 發光，暗室曝光。將曝光后的 X光片放入掃描儀內進行掃描，采用Image-Pro Plus6.0軟件對掃描得到的蛋白條帶進行光密度分析。

1.6 caspase-3 活性檢測 如1.5中步驟制備胞漿蛋白，依照caspase-3 活性檢測試劑盒（碧云天試劑有限公司）說明書檢測caspase-3活性。

2 結 果

2.1 模擬失重對大鼠比目魚肌濕重影響及藥物干預效果 對照組大鼠比目魚肌肉眼觀察飽滿紅潤，彈性良好。尾吊組30 d比目魚肌明顯萎縮，彈性減退，肌肉變薄，色澤蒼白，重量減輕。對照組平均濕重體質量比為（0.051±0.001），尾吊組30 d后為（0.022±0.001），較對照組下降了56.39%（P＜0.05）；血府逐瘀組平均濕重體重比為（0.026±0.001），較尾吊組增加了14.49%，

差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 三組大鼠比目魚肌濕重對比

2.2 模擬失重對大鼠比目魚肌組織橫截面積的影響及藥物干預效果 如圖2、圖3所示：尾吊后大鼠比目魚肌面積較對照組減小；血府逐瘀組較尾吊組面積增加，但總體仍小于對照組。對照組平均肌肉橫截面積（cross-sectional area，CSA）為（2189.5±95.1） μm2，尾吊30 d后為（858.3±51.8） μm2，較對照組下降了60.79%（P＜0.05）；血府逐瘀組CSA為（1149.7±83.8）μm2，較尾吊組增加了25.34%，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 三組大鼠肌肉橫截面積的HE染色圖像（HE×400）

圖3 三組大鼠比目魚肌組織橫截面積比較

2.3 模擬失重對大鼠比目魚肌PI3K/AKT信號通路相關蛋白的影響及藥物干預效果 應用Western blot檢測PI3K/AKT通路相關蛋白表達，見圖4，促進細胞凋亡的相關蛋白BAX（Bcl-2相關X蛋白）各組表達差異無統計學意義，但可見其增高趨勢，Cyto-c各組表達變化差異有統計學意義（P＞0.05）。相反抑制細胞凋亡的保護性因子（PI3K、p-AKT、GRP-78）在血府逐瘀組中均較尾吊組表達增多，其中關鍵分子PI3K、p-AKT各組表達差異有統計學意義（P＞0.05）。

圖4 三組大鼠比目魚肌PI3K/AKT通路相關蛋白表達

2.4 模擬失重對大鼠比目魚肌胞漿caspase-3活性的影響及藥物干預效果 為進一步驗證藥物對尾吊后肌纖維細胞凋亡的保護作用，檢測了caspase-3活性表達水平的變化。30 d尾吊后對照組與尾吊組caspase-3活性相對表達水平[（0.591±0.199） vs （11.546±1.992）]相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。血府逐瘀組與尾吊組caspase-3活性相對表達水平[（4.176±0.598）vs （11.546±1.992）]相比，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 三組大鼠caspase-3活性變化

3 討 論

失重狀態下骨骼肌最為顯著的形態學變化是肌肉濕重及橫截面積的變化。主要包括骨骼肌重量減輕、體積減小，肌纖維橫截面積減小，其中抗重力肌的萎縮大于非抗重力肌，慢肌的萎縮大于快肌，尤其是下肢抗重力肌，如比目魚肌等[6]。從本研究結果可以看出，尾吊模擬失重后大鼠比目魚肌明顯萎縮，重量減輕，彈性減退，肌纖維CSA明顯減小。尾吊30 d后大鼠比目魚肌濕重體質量比下降了56.39%，尾吊組CSA較對照組下降了60.79%，這與以往的文獻[5]報道相一致，說明本研究選取的尾吊模擬失重模型較為成功。給予藥物干預后大鼠比目魚肌CSA較尾吊組增加了14.49%，差異具有統計學意義，說明血府逐瘀膠囊對模擬失重狀態下大鼠比目魚肌的萎縮有顯著的治療意義。

血府逐瘀膠囊主要成分為當歸、川穹、赤芍、紅花等，具有活血祛瘀，行氣止痛作用。血府逐瘀膠囊對頭痛、腹痛、肢體麻木、經期腹痛、微循環障礙或伴有脈弦、脈澀等癥候具有明顯的治療效果。血府逐瘀膠囊主要有抑制血小板聚集，改善血液流變性及微循環，抗缺氧，鎮痛，抗炎，降血脂及增強免疫功能等作用[6,7]。同時可明顯升高高密度脂蛋白膽固醇，改善脂質代謝紊亂，降低動脈硬化程度，改善血液流變學各項指標，增加肝細胞血流量[8]。本研究證明了活血類藥物具有抗失重狀態下肌萎縮的作用，主要表現在肌肉濕重和肌纖維橫截面積方面。

PI3K由催化亞基P110和調節亞基P85組成，活化的PI3K通過磷酸化磷脂酰肌醇和磷酸肌醇激酶激活AKT，AKT通過Ser473和Thr308兩個氨基酸殘基位點的磷酸化被激活，然后磷酸化各種轉錄因子，激活或抑制其下游靶蛋白Bad、GSK-3β、caspase-9、p21、NF-κB和p27等，增強抗凋亡基因和抑制凋亡基因的表達如Bcl-2家族等，進而調節細胞的增殖、分化、凋亡

及遷移等。活化的AKT可抑制凋亡啟動蛋白caspase-9的活性，中斷下游通路，抑制其促凋亡作用[9]。體外實驗也同樣證實了該通路參與了肌細胞的代謝合成[10]。磷酸化的AKT可抑制E3泛素連接酶MuRF1和MAFbx的轉錄，誘導蛋白質的合成。同時活化的PI3K/AKT通路可抑制肌抑制素myostatin的活性，從而增加骨骼肌纖維的橫截面積[11]。

葡萄糖調節蛋白GRP78是熱休克蛋白70家族中的成員，為內質網應激ERS的標志性分子之一[12]。內質網應激時，細胞內啟動未折疊蛋白反應UPR信號途徑，上調內質網伴侶蛋白協助蛋白折疊，促進錯誤折疊的蛋白降解，降低蛋白合成速率來減小內質網負擔并促進重建內質網穩態。內質網應激首先啟動生存信號，給細胞提供修復機會，不能代償時才轉而啟動促凋亡機制，清除過度損壞的細胞。通過應用PI3K/AKT小分子抑制劑、質粒轉染和siRNA干擾等技術研究發現，PI3K/AKT信號通路可正向調節GRP78的表達。應用PI3K的抑制劑及敲除FOXO1轉錄因子，活化的AKT水平和內質網伴侶蛋白急劇下降，其中GRP78蛋白表達水平下降了80%。因此，有學者認為IGF-1通過調節PI3K/AKT通路調節GRP78表達，GRP78為IGF-1/ PI3K/AKT的一個下游分子[13]，GRP78參與骨骼肌組織代謝先前已有報道[14]，本研究結果觀察到尾吊30 d顯著抑制了PI3K/AKT通路活性，藥物干預后PI3K/AKT通路活性顯著增強，活化的AKT表達增加。對應的觀察到尾吊30 d后GRP78蛋白水平和轉錄水平表達下降，藥物干預后又相應增加了其表達水平，但仍較對照組為低，并且各組間轉錄水平的變化具有顯著性差異。這種現象說明了磷酸化AKT及GRP78表達水平變化的一致性，與既往研究結果基本一致[15]。但骨骼肌系統中具體作用途徑是否是通過PI3K/AKT途徑仍不清楚。在未來，筆者后續研究工作將給與特異性的阻斷劑和誘導劑，來進一步驗證該通路的具體作用途徑。

caspase-3在細胞核凋亡過程中也起到了關鍵作用，也是內質網應激凋亡的最終執行蛋白。Dupont-Versteegden等[16]研究同樣觀察到隨著失重狀態下骨骼肌萎縮的加重，通過TUNEL可以檢測到陽性凋亡的增加。肌肉橫截面積的萎縮在尾吊2 d后最明顯，而凋亡增加最明顯是在尾吊12 h 。本研究中檢測到尾吊30 d模型中caspse-3活性明顯增高，這與文獻[17]研究結果相一致。并且下游的標志蛋白BAX的表達量與caspase-3活性增加相一致，與胞漿釋放的Cyto-c變化相一致。血府逐瘀干預后可以有效抑制凋亡的產生，防止骨骼肌的萎縮。

骨骼肌細胞為多核細胞，其凋亡的過程要比經典單核細胞的凋亡途徑復雜。目前多數學者及本研究仍支持失重狀態下肌萎縮過程涉及肌纖維細胞的凋亡參與，并且凋亡過程可以觀察到凋亡執行者caspase-3的活性增強，但仍有部分學者反對這種觀點[18]。本研究結果首次證實了內質網應激參與了失重性肌萎縮的調控，但其具體的作用機制并不十分清楚，從基因水平檢測到PI3K/AKT通路和內質網應激的標記蛋白GRP78相一致的變化趨勢，那么PI3K/AKT及內質網應激各通路間交叉調節將是本研究下一步工作的重點。這些差異及信號轉導的具體機制的深入研究，可能會進一步揭開細胞信號轉導的客觀本質。

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（2016-09-28 收稿 2016-10-24修回）

（責任編輯 潘奕婷）

Protective effect of Xuefu Zhuyu capsule on skeletal muscle atrophy under simulated weightlessness

ZHANG Shu1, YUAN Ming2, and WU Shiwen1. 1. Department of Neurology, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China; 2. Scientific Research Training Center for Chinese Astronauts, Beijing 100094, China

Objective To discuss the protective effect of Xuefu Zhuyu capsule on skeletal muscle atrophy under simulated weightlessness. Methods Tail-suspended rat was taken as the animal model of simulated microgravity. 30 homologous Sprague-Dawley male rats (aged 10 weeks, weighing 200-250g) were randomly divided into three groups, including control group, tail-suspended group, Xuefuzhuyu group (tail-suspended + Xuefu Zhuyu capsule). The 25 mg/(kg·d) Xuefu Zhuyu was administrated to the Xuefu Zhuyu group, while the 1ml/d solvent to the control group and tail-suspended group. All the rats received the intragastric administration at eight o'clock every day. (1) The soleus morphological changes were measured, including the wet weight of body weight, the cross-sectional area of muscle fibers. (2) The protein and mRNA expression of PI3K/AKT, and some downstream proteins such as BAX and Cyto-c were detected by Western-blot and RT-PCR. (3) The caspase-3 activity was detected by caspase-3 fluorometric assay kit. Results 30 rats were all taken in the result analysis, without any loss. (1) Compared with the control group, the wet weight of soleus muscle of the tail-suspended group decreased by 56.39%; compared with the tail-suspended group, the average wet weight of Xuefu Zhuyu group increased 14.49%, and the differences were both significant (P＜0.05). (2) After tail-suspended for 30 days, the content of P-AKT and GRP78 decreased under simulated microgravity, but the activity of Akt and GRP78 of Xuefu Zhuyu group increased compared with that of control group, and the differences was significant (P＜0.05). (3) The caspase-3 activity of soleus muscle increased after tail-suspended for 30 days. And the caspase-3 activity of Xuefu Zhuyu group was lower than that of tail-suspended group, and the differences was significant (P＜0.05). Conclusions (1) Simulated microgravity may play an important role in the soleus muscle atrophy, which increases the caspase-3 activity through inhibiting protein expression level related to the PI3K/AKT pathway. (2) Xuefu Zhuyu capsule may have protective effect on muscle atrophy induced by weightlessness by increasing protein expression level related to the PI3K/AKT pathway.

microgravity; muscle atrophy; Xuefuzhuyu capsule; PI3K/AKT

R746

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.11.005

武警總醫院院內課題三類（WZ2012041）

張 淑，碩士，主治醫師，E-mail：neurozhangshu@126.com

1. 100039 北京，武警總醫院神經內科；

2. 100094 北京，中國航天員科研訓練中心

吳士文，E-mail：wu_shiwen@yahoo.com