傳統酵子中產香酵母菌的分離·鑒定及發酵香氣的檢測

付 娜，王錫昌， 杜 毅， 黃 健

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.愛普香料集團股份有限公司，上海 201809)

?

傳統酵子中產香酵母菌的分離·鑒定及發酵香氣的檢測

付 娜1,2，王錫昌1*， 杜 毅2， 黃 健2

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.愛普香料集團股份有限公司，上海 201809)

[目的]從酵子中篩選出發酵香氣較好的菌種，使其發酵產物能增強發酵面制品風味。[方法]通過平板劃線分離法，從傳統酵子中分離出1株酵母樣真菌，對其形態學特征及18S rDNA區序列進行分析，采用氣相色譜-質譜(GC-MS)法對該菌株糊化小麥淀粉發酵產生的揮發性香氣成分進行檢測。[結果]被命名為FN001的該菌株屬于Wickerhamomycesanomalus,該酵母菌發酵產生的香氣組分主要為酯類、醇類和酸類，包括乙醇、乙酸乙酯、丁醇、丁酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸丁酯、苯乙醇、丁酸、乙酸等，其中，乙醇的相對百分含量高達20.33%、乙酸乙酯14.52%、丁醇14.51%、乙酸丁酯13.90%。[結論]利用此菌株發酵可為發酵面制品提供較濃郁的香氣來源。

酵子；異常威克漢姆酵母；氣相色譜-質譜聯用法

冷凍面團的應用為發酵面食制品工業化、標準化、連鎖化生產創造了條件[1]。其中，發酵劑是必不可少的。酵子是一種多菌發酵劑，含有大量能夠產生風味物質的微生物，賦予發酵面制品特殊風味[2]，但是酵子的發酵力較弱，需要消耗較長的發酵時間。要想在適應工業化的過程中達到豐富發酵面制品口感的效果，可將酵母發酵產香過程單獨進行，而菌種的分離與培養會使研究工作更精細化、具體化。

在研究發酵產香的微生物中，酵母發酵產香的報道較為常見。在以往研究中，李銳等[3]研究了不同來源釀酒酵母對柑橘果酒香氣成分的影響，付俊淑等[4]對分離出的酵母菌菌株進行分子鑒定和揮發性香氣的檢測分析，廖永紅等[5]對產香酵母和其發酵香氣進行了研究。筆者從酵子中篩選出1種產香能力較好的酵母菌，并以篩選出的酵母菌為研究對象，鑒定其種屬，且在糊化淀粉溶液下進行發酵，從而得出一種可以改善發酵面團風味的輔料，為冷凍面團制品風味改良提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 傳統酵子，采自河南省商丘市，酵母樣真菌FN001分離于此傳統酵子。7890A氣相色譜儀、5975質譜儀，Agilent 公司；固相微萃取裝置及50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母樣真菌的篩選。分離培養基與純化培養基為PDA和YPD培養基[6]。將酵子碾碎后取0.1 g溶于無菌水中用無菌玻璃棒攪拌均勻并靜置0.5 h，取0.5 mL溶液接種到平板上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，當平板上長出菌落時，用接種環挑取菌落，連續劃線傳代培養幾次，即得純化的菌株，選出發酵香氣較濃的菌種。

1.2.2 18S rDNA的測定。將分離出的酵母樣真菌送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行18S rDNA測定。根據供試菌株的序列，在GenBank數據庫中分別進行同源序列搜索。

PCR 反應條件：采用三溫度點法，雙鏈DNA在95 ℃下保持30 s變性，再迅速冷卻至55 ℃保持30 s，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至72 ℃并保持40 s，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。循環次數為35次。

1.2.3 酵母菌發酵。將活化好的酵母菌株接種到4%的蔗糖溶液中，接種量為5.1×106個/mL，當酵母菌達到5.0×107個/mL時，加入含水量為91%的糊化小麥淀粉溶液中，于28 ℃下通氣培養，72 h發酵后取樣并進行上機檢測香氣成分。

1.2.4 香氣物質提取。精確量取10 mL發酵液放入15 mL頂空瓶中，萃取溫度為60 ℃，用萃取頭萃取40 min，進樣進行氣相色譜-質譜(GC-MS)分析。1.2.5 GC-MS分析條件。色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.5 μm)；程序升溫為40 ℃保持1 min，以6 ℃/min升至100 ℃，以3 ℃/min升溫至200 ℃，以10 ℃/min升溫至210 ℃，保持3 min。進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，無分流進樣。載氣，高純He(99.999%)；載氣流速1.0 mL/min。

電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，全掃描模式，質量掃描范圍為40～600 u。

1.2.6 香氣成分的分析。用氣相色譜-質譜-計算機聯用儀進行分析鑒定。分析結果運用計算機譜庫( NIST08 和WILEY7) 進行初步檢索及資料分析，再結合文獻進行人工譜圖解析，確認香氣物質的各化學成分，并用氣相色譜峰面積歸一化定量計算出各香氣成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 FN001菌株的培養和形態特征 將FN001菌株培養于PDA培養基上，于28 ℃培養2 d后，菌落為圓形，乳白色，質地均勻，邊緣整齊，表面光滑、濕潤、黏稠、易挑取，并散發出發酵香氣，光學顯微鏡下細胞呈球形，進行出芽生殖(圖1)。

注：“o”內表示出芽生殖。Note: o indicated gemmation.圖1 酵母菌的菌落形態與繁殖方式Fig.1 Colony morphology and propagation mode of FN001

2.2 18S rDNA檢測結果 隨著現代生物學技術的發展，染色體核型分析、核糖體內轉錄間隔區分析(ITS 序列)、核糖體分析和肌動蛋白基因分析等將取代傳統的酵母分類方法[7-9]。該試驗對分離出的酵母真菌FN001進行18S rDNA測定，其PCR擴增膠圖見圖2。

試驗得出FN001真菌的拼接序列：TTTACTACTTGGTAT

AACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCG

ACTGTTTGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAATCAATGC

TCTTCTGAGCTCTTTGATGATTCATAATAACTTTTCGAATCGC

ATGACTTCGTGTCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTA

TCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTCAAC

GGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCC

TGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCG

CAAATTACCCAATCCTAATTCAGGGAGGTAGTGACAATAA

ATAACGATACAGGGCCCATTTGGGTCTTGTAATTGGAATGA

GTACAATGTAAATACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCA

AGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGC

GTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACT

TTGGGCTTGGTCAGCCGGTCCGCTTTTTTGCGTGTACTGGTCC

TGACCGAGCCTTTCCTTCTGGCTAACCTGTCTCTCGGGGCAG

GCGAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAA

GCAGGCCTTTGCTCGAATATATTAGCATGGAATAATAGAATA

GGACGTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCATCGTAAT

GATTAATAGGGACGGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCA

GAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAA

AGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTT

AGGGGATCGAAGATGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCA

TAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGTGGTGTTTTTTATATAC

CCACTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGG

GGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACG

GAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGAC

TCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATAAGGAT

TGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTG

CATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTG

CGATAACGAACGAGACCTTAACCTACTAAATAGTGCGATTA

GCTTTTGCTGATTTTGACACTTCTTAGAGGGACTATCGATTTC

AAGTCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCC

CTTAGACGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGC

CAGCGAGTAATAACCTTGGCCGAGAGGTCTGGGTAATCTTG

TGAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTG

CTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCT

TGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCG

CTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCTTCCGGA。

樣本序列比對結果顯示：異常威克漢姆酵母18S核糖體RNA基因的部分序列；內轉錄間隔區1，5.8S核糖體RNA基因；內轉錄間隔區2，全序列；和28S核糖體RNA基因的部分序列最大得分2 856，總得分2 856，查詢范圍100%，E值0.0，識別率100%。經鑒定該菌株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。

圖2 PCR擴增膠圖Fig.2 Plastic figure of PCR amplification

2.3 發酵香氣檢測 考慮到工業應用及篩選此菌株的目的，該研究采用4%的蔗糖溶液為活化酵母的溶液，以糊化小麥淀粉為發酵底物，發酵過程中產生的揮發性成分經質譜檢測，結果見表1。

由表1可知，篩選的酵母在糊化小麥淀粉溶液中發酵72 h后，共檢測出香氣組分22種，其中醇類5種，酯類11種，酸類2種，另外還含有甘油、苧烯、苯乙醛與乙基麥芽酚。

醇類相對百分含量為42.32%，分別是乙醇、丁醇、異戊醇、己醇、苯乙醇。其中乙醇和丁醇的相對百分含量最高，為20.33%、14.50%，且乙醇具有特殊香味，微甘，并伴有刺激的辛辣滋味，而丁醇具有酒味。

酯類相對百分含量為49.39%，分別為乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、γ-丁內酯、丁酸丁酯、丁酸異戊酯、丁酸-2-甲基丁酯、水楊酸甲酯、乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯。其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯與丁酸丁酯的含量較高，分別為14.52%、10.17%、13.90%和8.06%，乙酸乙酯具有強烈的醚似的氣味，清靈、微帶果香的酒香，丁酸乙酯、丁酸丁酯和乙酸丁酯具有使人愉悅的果香。另外，含量較少的酯類有乙酸異戊酯、γ-丁內酯、水楊酸甲酯、乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯。酵母在發酵過程形成的酯類，可以由有機酸(乙酸、乳酸等)與高級醇通過酯化反應產生[10]。

酸類相對百分含量為6.50%，分別為乙酸(3.22%)和丁酸(3.28%)，乙酸具有刺激的辛辣味，丁酸帶有難聞的氣味。

除以上三大類物質之外，發酵香氣成分中還含有甘油、苧烯、苯乙醛、乙基麥芽酚，相對百分含量分別為0.53%、0.56%、0.17%和0.53%。其中，苯乙醛具有類似風信子的香氣，稀釋后具有水果的甜香氣，乙基麥芽酚的溶液具有甜香味。

在以往研究發酵產香的微生物中，酵母發酵產香的報道較為常見，高健等[6]從萵苣中分離出1株產香酵母，該酵母發酵產生的香氣組分主要是烯類和醇類，其中檸檬烯的相對含量高達20%。該研究從酵子中分離到的FN001菌株發酵糊化淀粉產生的香氣中，香氣組分主要是醇類與酯類，占總香氣物質含量的80%以上。

表1 酵母發酵72 h后的香氣成分及相對含量

3 結論與討論

該研究從酵子中分離到1株酵母樣真菌，命名為FN001，結合18S rDNA序列分析，該菌株被鑒定為Wickerhamomycesanomalus。鑒于菌株培養時所發出的發酵香氣及其工業應用，該研究采用GC-MS 手段，檢測了菌株發酵糊化淀粉產生的各種揮發性成分。結果表明，菌株產生的揮發性成分大多為醇、酸、酯類，且酯類和醇類相對百分含量較高，分別為49.39%和42.32%。因此，該菌株的分離為利用微生物高效生產豐富發酵面制品風味物質提供了較好的研究材料。

[1] 王文果.冷凍面團的研究與發展[J].四川食品與發酵, 2006, 42(3): 15-19.

[2] 楊敬雨, 劉長虹.中國傳統酵子的工業化[J].食品研究與開發, 2007,28(2):164-166.

[3] 李銳, 馮奎, 吳婧, 等.不同來源釀酒酵母對柑橘果酒香氣成分的影響[J].食品科學, 2010, 31(17): 206-213.

[4] 付俊淑, 莊世文, 徐丹丹, 等.酵母分離株分子鑒定及其揮發性香氣成分檢測分析[J].食品與發酵工業, 2010, 36(2): 44-48.

[5] 廖永紅, 沈晗, 石文娟, 等.產香酵母碳源利用及發酵產香特性初步研究[J].食品與發酵工業, 2010, 36(2): 1-6.

[6] 高健, 許愛清, 唐新科.一株萵苣內生產香酵母菌的分離、鑒定及揮發性香氣成分分析[J].食品科學, 2011,32(23):162-166.

[7] WANG S A, BAI F Y.Saccharomycesarboricolussp.nov., ayeast species from tree bark[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2008, 58(Pt 2): 510-514.

[8] ESPOSTO M C, COGLIATI M, TORTORANO A M, et al.Electrophoretic karyotyping ofCryptococcusneoformansAD-hybrid strains[J].Mycoses, 2009, 52(1): 16-23.

[9] DANIEL H M, SORRELL T C, MEYER W.Partial sequence analysis of the actin gene and its potential for studying the phylogeny of Candida species and their teleomorphs[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2001, 51(Pt4): 1593-1606.

[10] 李華, 王華, 袁春龍, 等.葡萄酒工藝學[M].北京: 科學出版社, 2007:75-80.

Isolation and Identification of Aroma-producing Yeast from Traditional Jiaozi and Detection of Its Fermentation Aroma

FU Na1,2, WANG Xi-chang1*, DU Yi2et al

(1.College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2.APPLE Flavor & Fragrance Group Co., Ltd., Shanghai 201809)

[Objective] To screen better fermented aroma strains from Jiaozi, and to enhance the flavor of fermented flour products.[Method] A strain of yeast was isolated from Jiaozi by streak plate method.Morphological characteristics and 18S rDNA analysis revealed that it was named as strain FN001.The major volatile compounds produced by the strain were identified by gas chromatography-mass spectrometry, which were esters, alcohols and acids.They included ethanol, ethyl acetate, butanol, ethyl butyrate, butyl acetate, butyl butyrate, phenethyl alcohol, butyrate and acetic acid.Among them, relative content of ethanol was as high as 20.33%, those of ethyl acetate, butanol and butyl acetate were 14.52%, 14.51% and 13.90%, respectively.[Conclusion] Strain FN001 was used to provide a rich aroma of fermented products.

Jiaozi;Wickerhamomycesanomalus; GC-MS

國家自然科學基金項目( 31271900 )。

付娜(1985- )，女，河南商丘人，博士，從事食品營養與風味化學研究。*通訊作者，教授，博士，從事食品營養與風味研究。

2016-09-09

TS 201.3

A

0517-6611(2016)32-0089-03