膠原誘導性關節炎大鼠在中藥作用下對其關節炎指數、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG的影響探討

楊帆 楊勇 廉婧 彭頁 劉巍

(1. 火箭軍總醫院禮士路門診部，北京 100820；2. 火箭軍總醫院骨科，北京 100088；3. 解放軍總醫院南樓臨床部消化內科，北京 100853；4.中國人民解放軍空軍總醫院骨科，北京 100142；5.中國人民解放軍第四一三醫院麻醉科，浙江 舟山 316004)

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膠原誘導性關節炎大鼠在中藥作用下對其關節炎指數、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG的影響探討

楊帆1楊勇2廉婧3彭頁4劉巍5△

(1. 火箭軍總醫院禮士路門診部，北京 100820；2. 火箭軍總醫院骨科，北京 100088；3. 解放軍總醫院南樓臨床部消化內科，北京 100853；4.中國人民解放軍空軍總醫院骨科，北京 100142；5.中國人民解放軍第四一三醫院麻醉科，浙江 舟山 316004)

目的 探討膠原誘導性關節炎大鼠在中藥作用下對其關節炎指數、白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、核因子-kB受體活化因子配體(RANKL)及護骨素(OPG)的影響。方法 取Wistar大鼠48只隨機分為空白組、模型組、陽性組、A、B、C組。復制膠原誘導性關節炎大鼠模型，連續干預 4周后，各組大鼠眼眶靜脈取血，觀察關節炎指數、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG。結果 與空白組相比，其余各組大鼠關節炎指數均明顯增加(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組關節炎指數均明顯降低(P<0.05)。與空白組相比，模型組血清IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組血清IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平明顯降低(P<0.05)，且A、B、C組大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用及對RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情況均優于陽性組(P<0.05)。組織病理學結果顯示，A、B、C組可抑制 CIA 大鼠關節組織病理學改變。結論 自擬除痹湯可明顯降低CIA模型大鼠的關節炎指數及關節組織病理學改變，下調IL-1β、TNF-α、PGE2水平，抑制RANKL、OPG，從而可以有效防治CIA。

膠原誘導性關節炎； 白細胞介素1β； 腫瘤壞死因子α； 前列腺素E2； 核因子-κB受體活化因子配體； 護骨素

類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病，反復發作，其發病主要靶組織是作用于關節滑膜[1]。RA多發于30歲后患者，女性發病高于男性。對于RA的治療，西醫主要以非甾體類抗炎藥、基因免疫及外科手術治療作為基本治療方法，雖然上述方法在短期內能夠緩解癥狀、在一定程度上能夠阻止骨關節病變的繼續進展 ，然而長期應用后，往往加重機體自身免疫失調[2]。中醫藥在治療RA過程中有自己獨特的優勢，且不良反應較少，成為目前廣大專家關注的熱點內容[3]。然而，中醫藥作為規范的診療方案指導臨床，目前尚缺乏理論基礎和實驗數據的支持。基于此，筆者采用Ⅱ型膠原蛋白誘導法造模膠原誘導性(CIA)大鼠模型，給予自擬除痹湯進行治療，觀察其對CIA大鼠關節變化的影響，以期為臨床治療RA提供理論及實驗依據。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑及儀器 自擬除痹湯(方藥組成：駱駝篷草、鹿含草、當歸、補骨脂、桑寄生、黃芪、續斷、白術、炒麥芽、細辛，均購自張仲景大藥房)，上述諸藥加水煎煮、抽濾、蒸發濃縮成水煎劑(相當于生藥1.90 g/mL)。雷公藤多苷片：由浙江普洛康裕天然藥物有限公司生產，批準文號：國藥準字Z33020778。弗氏完全佐劑(FAC)、Ⅱ型膠原蛋白由上海鈺博生物科技有限公司提供。冰醋酸：由張家港保稅區明樂化工有限公司提供。TNF-α試劑盒由上海基免實業有限公司提供。IL-1β試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供。PGE2試劑盒由上海研謹生物科技有限公司提供。RANKL試劑盒由上海豐壽實業有限公司提供。OPG試劑盒由上海喬羽生物科技有限公司提供。

1.2 實驗動物 Wistar大鼠, 雄性，體質量180～200 g，由山東魯抗醫藥有限公司提供，生產許可證號：SCXK(魯)20130001。

1.3 方法 取大鼠48只，采用隨機數字分組法將其分為空白組、模型組、陽性組、自擬除痹湯大計量組(A組)、自擬除痹湯中計量組(B組)、自擬除痹湯小計量組(C組)，每組8只。除空白組外，將Ⅱ型膠原蛋白用弗氏完全佐劑(FAC)配成3.0 mg/mL的乳劑，在大鼠左后足跖皮內注射,110 μL/只，復制CIA大鼠模型。其中，空白組大鼠左后足跖皮內注射同體積的生理鹽水。連續造模10 d?？瞻捉M、模型組大鼠給予同容積生理鹽水，A組、B組、C組給予自擬除痹湯(生藥38.0 g/kg，19.0 g/kg，9.5 g/kg)，陽性組給予雷公藤多苷片混懸液5.0 g/kg，連續給藥4周。所有大鼠每周稱重1次。

1.4 指標測定 (1)采用0～4級評分法對關節炎指數進行評分，滿分為18分：①0分，趾關節未見紅腫；②1分，趾關節出現紅腫；③2分，趾關節及足趾均出現腫脹；④3分，趾關節以下足爪出現腫脹；⑤4分，全部足爪均出現腫脹且嚴重變形。(2)TNF-α、IL-1β、PGE2水平測定：采用ELISA法對大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2水平進行測定。(3)RANKL及OPG表達測定：采用ELISA法對RANKL及OPG進行測定。(4)病理學檢查：處死大鼠，取關節滑膜組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察各組大鼠病理組織變化。

2 結 果

2.1 不同組別大鼠的關節炎指數對比 與空白組相比，其余各組大鼠關節炎指數均明顯增加，且差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組關節炎指數均明顯降低，且差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表1。

表1 不同組別大鼠的關節炎指數對比

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05。

2.2 不同組別大鼠TNF-α、IL-1β、PGE2水平影響對比 與空白組相比，模型組血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平明顯降低(P<0.05)，且A、B、C組大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用優于陽性組(P<0.05)。結果見表2。

表2 不同組別大鼠對TNF-α、IL-1β、PGE2水平影響對比

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05。

2.3 不同組別大鼠RANKL及OPG表達的對比 與空白組相比，模型組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均顯著降低(P<0.05)，且A、B、C組大鼠血清RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情況均優于陽性組(P<0.05)。結果見表3。

表3 不同組別大鼠RANKL及OPG表達的對比

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05。

2.4 不同組別大鼠關節滑膜組織病理組織結果對比 病理學結果顯示，空白組關節腔滑膜結構清晰，細胞排列整齊，滑膜內未見炎性細胞浸潤，關節軟骨及滑膜下細小血管均未見異常。模型組關節腔滑膜細胞增生明顯、呈散亂性排列、且大小不一、間隙狹窄，部分細胞已纖維化，漿細胞、淋巴細胞、單核細胞等大量炎性細胞充斥于滑膜內，滑膜組織廣泛水腫，可見多發的細小血管，嚴重部分己形成管黯，關節軟骨表面剝脫，侵蝕嚴重。陽性組病變程度與自擬除痹湯各組基本相同，表現為：關節腔滑膜增生不明顯，僅有部分鏡下存在細胞間隙和排列不齊，可見部分組織水腫，并可見少量炎性細胞，其中，A組滑膜下可見散片的毛細血管，但較模型組明顯減少，未見血管黯，關節軟骨仍有表面侵蝕，較模型組略有減輕。結果見圖1。

3 討 論

RA是臨床常見的慢性自身免疫性疾病，對于RA的發病機制較為復雜，至今尚無定論[4]。研究[5]發現，細胞因子在RA的發病過程占據重要地位，尤其是IL-1β、TNF-α在RA的發病中扮演舉足輕重的地位。TNF-α是產生于滑膜及軟骨血管翳的巨噬細胞，屬于炎癥分子，能夠向上調節滑膜細胞中的細胞因子、PGE2等。研究[8]認為，在類風濕性關節炎發生時， IL-1基因在CD14+巨噬細胞中具有優勢表達。IL-1對于滑膜細胞及浸潤的淋巴細胞具有增殖和分化作用，有助于促進花生四烯酸的生成，可導致PGE2及膠原酶的合成與釋放[6]。研究[9]發現，RANKL可介導破骨細胞的增殖活化，這在RA骨質破壞進程中起著重要的作用。OPG是腫瘤壞死因子受體超家族中一員[7]，是一種可溶性蛋白質，是RANKL的天然阻斷受體，能夠阻斷與RANK的結合，抑制破骨細胞的增殖活化。

研究[8]發現，一些中藥能夠有效抑制炎癥因子，阻止破骨細胞增殖活化，使RANKL降低、護骨素升高、調節RANKL/OPG比值[9]，發揮其抑制關節破壞及骨吸收的作用。本研究所用自擬除痹湯具有補益肝腎、滋養氣血、散寒祛瘀通絡之功效。方中駱駝蓬草能夠堅固筋骨、散寒除濕；配伍鹿含草以養肝補腎、強筋壯骨、祛風、除濕、止血；合用當歸以補血活血、調經止痛、潤腸通便；配伍補骨脂以溫腎助陽、止瀉；桑寄生具有除風濕、通經絡、益血、安胎之功效，黃芪具有補氣固表、利水退腫、祛毒排膿、生肌之功效；續斷具有補益肝腎、強筋健骨、止血安胎、療傷續折之功效；白術具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎之功效；炒麥芽具有行氣消食、健脾開胃、退乳消脹之功效；細辛具有祛風散寒、通竅止痛、溫肺化飲之功效[9]。本方配伍合理，諸藥相合共奏補益肝腎、滋養氣血、散寒、祛瘀、通絡之功效。現代藥理研究[10-11]表明，當歸、黃芪能夠抑制IL-1β、IL-2及TNF-α，發揮抗炎、鎮痛的作用；補骨脂抑制過高的免疫球蛋白IgA、IgG及IgM恢復正常。

本組研究結果顯示，與空白組相比，其余各組大鼠關節炎指數均明顯增加。與模型組相比，陽性組、A、B、C組關節炎指數均明顯降低。與空白組相比，模型組血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平均明顯升高。與模型組相比，陽性組、自擬除痹湯大、中、小劑量組血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平明顯降低，且A、B、C組大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用優于陽性組。與空白組相比，模型組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均明顯升高。與模型組相比，陽性組、A、B、C組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均顯著降低，且A、B、C組大鼠血清RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情況均優于陽性組。組織病理學結果顯示，A、B、C組下可抑制 CIA 大鼠關節組織病理學改變。上述結果提示，自擬除痹湯能夠明顯改善CIA模型大鼠引起的類風濕性關節炎。

綜上所述，自擬除痹湯可明顯降低CIA模型大鼠的關節炎指數及關節組織病理學改變，下調IL-1β、TNF-α、PGE2，抑制RANKL、OPG，從而達到有效防治CIA的目的。

(本文圖1見封三)

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Effect of arthritis index, IL-1β, TNF-α and PGE2level, RANKL and osteoprotegerin by collagen induced arthritis in rats under the action of traditional Chinese Medicine

YangFan1,YangYong2,LianJing3,PengYe4,LiuWei5.

1.DepartmentofClinicinLishiRoad,GeneralHospitalofRocketArmy,Beijing100820,China. 2.DepartmentofOrthopedics,GeneralHospitalofRocketArmy,Beijing100088,China. 3.DepartmentofDigestionMedicineofClinic,GeneralHospitalofChinesePeopleLiberationArmy,Beijing100853,China. 4.DepartmentofOrthopedics,AirForceGeneralHospitalofChinesePLA,Beijing100142,China. 5.DepartmentofAnesthesiology,the413HospitalofChinesePLA,Zhoushan316004,China.

Objective To discuss the effect of arthritis index, IL-1β, TNF-α and PGE2level, RANKL and OPG by collagen induced arthritis in rats under the action of traditional Chinese Medicine. Methods According to the random number table, 48 wistar rats were divided into the normal control group, model group, positive control group, group A, B, C. All rats were copied the model of collagen induced arthritis, after 4 weeks of continuous intervention, each rat were orbital venous blood, and then were observed arthritis index,IL-1β,TNF-α and PGE2, RANKL and OPG. Results Compared with the control group, arthritis index of rats in other groups were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the arthritis index of the positive group and group A，B，C were decreased significantly (P<0.05). Compared with the blank group, the levels of IL-1β，TNF-α，PGE2，RANKL,OPG and RANKL/OPG of serum of the model group rats were significantly increased (P<0.05).The levels of IL-1β，TNF-α，PGE2，RANKL, OPG and RANKL/OPG of serum in the positive group, group A, B, C were significantly decreased than that of the model group (P<0.05), and the inhibition of the levels of IL-1β, TNF-α, PGE2and the improvement of the RANKL,OPG and RANKL/OPG of serum in the group A, B, C were better than the positive group (P<0.05). Histopathological results showed that the group A, B, C could inhibit the pathological changes of articular tissue in CIA rats. Conclusion The ZI NI CHU BI TANG can significantly reduce arthritis index and the histological change of articular tissue pathology, reduce the level of the IL-1β, TNF-α, PGE2, inhibit the RANKL, OPG, and then can effectively prevent CIA.

Collagen-Induced Arthritis； IL-1β； TNF-α； PGE2； RANKL； Osteoprotegerin

國家自然科學基金(項目編號81403451)

R285.5

A

1000-744X(2016)09-0902-03

2016-04-13)

△通信作者，E-mail:1039331979@qq.com