S1P致環磷酰胺染毒后雄性小鼠凋亡蛋白表達的影響

劉丹薇 潘衛 徐國賓 楊國珍△

(1.貴州醫科大學，醫學檢驗學院生化學教研室，貴州 貴陽 550004；2.北京大學腫瘤醫院檢驗科，北京 100142)

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S1P致環磷酰胺染毒后雄性小鼠凋亡蛋白表達的影響

劉丹薇1潘衛1徐國賓2楊國珍1△

(1.貴州醫科大學，醫學檢驗學院生化學教研室，貴州 貴陽 550004；2.北京大學腫瘤醫院檢驗科，北京 100142)

目的 探討1-磷酸鞘氨醇(S1P)對雄性小鼠生殖細胞毒性損害的拮抗機制。方法 健康雄性昆明小鼠40只，隨機分為5組，即正常對照組；S1P低劑量(0.5 μg/10 g小鼠體質量)、中劑量(1.0 μg/10 g小鼠體質量)、高劑量(2.0 μg/10 g小鼠體質量)組；環磷酰胺染毒組。腹腔注射給藥5 d，于首次給藥后30 d處死。分別采集睪丸樣本，小鼠睪丸病理切片觀察睪丸組織的病理學改變，免疫組化檢測小鼠睪丸凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達。 結果 與環磷酰胺染毒組相比：各S1P劑量組病理學結構均有不同程度的改善， Bcl-2蛋白表達增強，Bax、Caspase-3蛋白表達減弱。經圖像分析軟件分析后得出平均光密度值，各實驗組與染毒組相比差異有統計學意義(P<0．05)。結論 S1P對雄性小鼠生殖細胞毒性損害具有一定的拮抗作用，可能通過活化Bcl-2和抑制Bax，抑制下游Caspase-3的表達來拮抗環磷酰胺所致的生殖毒性。

1-磷酸鞘氨醇； 雄性小鼠； 生殖毒性； 凋亡

據世界衛生組織(WHO)調查，當今社會大約有10%～15%的育齡夫婦不能夠自然生育，且該比例仍在不斷上升，其中1/2以上的不育癥發生原因與男性密切相關。在過去近50年里，全球男性精液質量下降十分顯著[1]。而在國內，形勢同樣不容樂觀，據調查，過去25年間國內育齡男性精液質量分析報告顯示，精子數量和精子活力均呈現出下降的趨勢[2]。根據前期研究發現，1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-Phosphate，S1P)可以抑制環磷酰胺致雄性小鼠生殖毒性的損害。故本研究利用S1P對環磷酰胺導致的生殖毒性進行拮抗，希望能闡明在環磷酰胺作用后S1P作為拮抗劑對于雄性小鼠生殖細胞凋亡蛋白表達的影響，初步揭示S1P拮抗雄性生殖細胞毒性損害作用的機制。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑與儀器 環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，S1P(美國Sigma公司)，Caspase-3，Bax，Bcl-2一抗(美國Cell Signaling公司)，一抗稀釋液(北京索萊寶科技有限公司)，免疫組化二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色系統(北京中杉有限公司)，蘇木素(北京中杉金橋生物有限公司)，電子精密天平(JJ500，常熟雙杰測試儀器)，光學顯微鏡(NIKON YS100，日本尼康公司)，電熱恒溫水浴箱(北京市光明醫療儀器廠)。

1．1．2 動物 本次實驗選擇SPF級成熟昆明種雄性小鼠40只，體質量25～35 g，動物由貴州醫科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK(黔)2012-0001。

1．2 實驗方法

1．2．1 動物分組與染毒 將雄性小鼠隨機分為5組，每組8只，分別為正常對照組；S1P低、中、高劑量拮抗組(0.5，1.0，2.0 μg/10 g小鼠體質量)；環磷酰胺染毒組。正常對照組按0.1 mL/10 g體質量給予生理鹽水；S1P低、中、高劑量拮抗組在給予環磷酰胺后間隔2 h再給予各劑量S1P；染毒組給予環磷酰胺40 mg/kg，連續腹腔注射給藥5 d，染毒期間小鼠自由飲食飲水。

1．2．2 取材及標本制作 各組于給藥結束后第30天，頸椎脫臼處死小鼠后立即打開腹腔，取出雙側睪丸；睪丸置于10% 甲醛固定，用于檢測病理學變化及相關凋亡蛋白。

1．2．3 睪丸組織HE染色切片觀察和生殖細胞凋亡蛋白檢測 取各組每只小鼠睪丸組織切片做HE染色，觀察睪丸組織學變化；取另一張組織切片檢測相關凋亡蛋白，具體操作按免疫組化檢測試劑盒說明書進行。光鏡下，細胞漿或細胞膜呈棕黃色為陽性表達，每張切片選取隨機5個高倍視野拍攝，圖像輸入IPP圖像分析系統，得出平均光密度值。

2 結 果

2.1 S1P對小鼠睪丸組織病理學的影響 如圖1所示，正常對照組小鼠睪丸曲精小管完整，排列密集整齊，生精上皮厚，生殖細胞層次和數量多，可見精原細胞和不同發育階段的精子，各級細胞排列精密，層次分明(圖1A)。染毒組睪丸生精小管直徑縮小，間距增寬，生精上皮變薄，管腔中生殖細胞數量減少，生精細胞排列紊亂、疏松，層數減少(圖1B)。S1P各劑量拮抗組形態結構隨拮抗劑量的增加，損傷程度逐漸減輕：低劑量組損傷明顯，與染毒組相比差異不大(圖1C)；中劑量組損傷明顯輕于染毒組(圖1D)；高劑量拮抗組損傷已經不明顯，與正常對照組相比差異不大(圖1E)。

注：A.正常對照組；B.環磷酰胺染毒組；C.S1P低劑量組；D.S1P中劑量組；E.S1P高劑量組。圖1 睪丸組織HE染色(×400)

2.2 S1P對小鼠生殖細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響 應用Image ProPlus圖像分析系統測得Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性表達的平均光密度值，Bcl-2：陽性表達產物呈棕黃色，主要位于細胞膜和細胞質。隨拮抗劑量增加，陽性表達逐漸增強(光密度值增加)(圖2 A1-E1)，S1P中、高劑量組與染毒組相比差異有統計學意義(P<0.01)，S1P高劑量組與正常對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。Bax：陽性表達產物呈棕黃色，主要位于細胞質。隨拮抗劑量增加，陽性表達逐漸減弱(光密度值減小)(圖2 A2-E2)，S1P低、中、高劑量組與染毒組相比差異有統計學意義(P<0.01)，S1P高劑量組與正常對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。Caspase-3：陽性表達產物呈棕黃色，主要位于細胞質。S1P拮抗組陽性表達隨拮抗劑量增加改變不明顯(圖2 A3-E3)，S1P低、中、高劑量組與染毒組相比陽性表達減弱(光密度值減小)，差異有統計學意義(P<0.01)；與正常對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1，圖2。

表1 S1P對各組實驗小鼠凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性表達的影響

3 討 論

細胞的死亡是多細胞生物整個生命過程中十分重要的環節，可及時清除機體內的衰老細胞和受損傷細胞，對各組織器官的發育及免疫系統的穩定發揮重要作用[3]。細胞凋亡是機體內細胞死亡的重要途徑。在哺乳動物體內線粒體通路在細胞凋亡機制中起著至關重要的作用。當細胞受到內部凋亡刺激因子作用，如DNA損傷、細胞缺氧、癌基因活化、生長因子缺失等，可激活細胞內部線粒體凋亡途徑，引起細胞凋亡。在眾多的凋亡調控基因中，Bcl-2和Bax同屬于Bcl-2家族蛋白，Bcl-2是目前已知的在凋亡調控過程中最重要的抗凋亡蛋白，同時含有BH1～BH4 四個同源結構域，其中BH4 是抗凋亡蛋白所特有的結構域，決定著抑制細胞凋亡功能的存在[4]。Bcl-2能定位在線粒體膜、內質網膜和核外膜上, 對保持膜的完整性至關重要。Bax蛋白則一般會以非活性單體形式分布于胞質中，當其在接收到凋亡信號刺激后，該蛋白被激活，從而發生一系列分子構象改變，插入線粒體外膜后形成Bax大孔道，從而導致線粒體膜的完整性被破壞，致使線粒體內部一些蛋白以及細胞色素C等得以通過線粒體膜進入細胞質[5]，在dATP 存在下細胞色素C能通過半胱氨酸蛋白酶作用域與Apaf-1 結合形成凋亡體，并吸引Procaspase-9 在凋亡體上進行寡聚，進一步激活蛋白Caspase-3，啟動Caspase 級聯反應[6]。Caspase-3屬于Caspase 蛋白家族中的凋亡效應亞類蛋白，位于級聯反應下游，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，被稱為“死亡執行蛋白酶”[7]。通常情況下，細胞內的Caspase-3是以無活性的單鏈酶原形式存在，只有在相關因子作用下，該類蛋白酶在受到相關起始凋亡蛋白酶的切割后被激活，活化后相應的凋亡蛋白酶可以對維持細胞骨架以及生命活動所必須的蛋白逐一進行裂解[8]，導致DNA損傷斷裂，細胞骨架的破壞，最終引起細胞死亡。目前已經證明，Caspase-3的激活在很大程度上依賴于上游細胞色素C的釋放。

通常情況下Bax和Bcl-2兩種蛋白的表達量是穩定而平衡的，而當Bcl-2高表達時，細胞內Bax/Bax二聚體會大量解離，生成更為穩定的Bcl-2/Bax二聚體，該二聚體可以對抗其誘導凋亡的作用，使細胞存活期延長[9]。反之，當細胞內Bax過量表達時，Bax/Bax同源二聚體的數量則會明顯增多，該類二聚體會使細胞對死亡信號的反應性增強，啟動凋亡。因此，目前認為Bax能與抑制凋亡的Bcl-2蛋白對抗，阻止其抗凋亡作用的發揮，細胞內這兩種對立蛋白間的比率關系是決定細胞存亡的關鍵[10]。本次研究結果顯示，Bcl-2陽性表達隨S1P劑量增加逐漸增強，Bax陽性表達隨S1P劑量增加逐漸減弱，表明S1P可能通過誘導活化Bcl-2以及抑制Bax激活來抵抗環磷酰胺造成的凋亡作用，使細胞增殖能力增強，從而減少生殖細胞的死亡，對機體組織起到一定的修復作用。

細胞色素C是線粒體電子傳遞鏈上的一個重要組成部分，凋亡啟動的關鍵步驟是細胞色素C從線粒體釋放[11]。Caspase-3的激活在很大程度上就依賴于細胞色素C的釋放。Bcl-2、Bax是線粒體膜的通透性改變的重要調控因素，它們位于線粒體上游，Bcl-2過度表達以及Bax的表達被抑制，這兩種情況皆能抑制Bax的轉位及二聚體化，使得 Bax大孔道關閉，控制細胞色素C的釋放。另一方面，研究[12]發現Bcl-2的過度表達可能會導致細胞核谷胱甘肽積聚，從而令核內氧化還原平衡發生改變，阻止胞內Ca2+流動，抑制線粒體膜釋放細胞色素C，最終抑制Caspase-3 的活化。Bcl-2也可作用在細胞色素C下游, 通過與細胞色素C結合, 將其從細胞漿池內轉移出去而抑制Caspases-3的活化。Bcl-2還可直接作用于類CED-4 分子，抑制下游Caspase-3 蛋白酶的活化。Caspase-3蛋白在本次研究中發現S1P劑量組的陽性表達均與正常對照組無明顯差異，但與環磷酰胺染毒組相比均有差異。這一結果與上述Bcl-2和Bax的蛋白表達并不矛盾，根據上述Bcl-2和Bax的蛋白表達結果可知，S1P誘導了Bcl-2蛋白的表達增加，抑制了Bax蛋白的表達，故可推測細胞色素C的釋放或與Caspase-3蛋白的結合受到抑制，致使Caspase-3蛋白的活化被抑制，蛋白表達不產生明顯變化。而為何各S1P實驗組所加S1P劑量不同， Caspase-3的蛋白表達卻與正常對照組相比均未有明顯差異，推測可能原因是各S1P實驗組S1P都使Bcl-2蛋白的表達上調，下游Caspase 級聯反應被阻斷，各組Caspase-3皆呈現低表達狀態，受本次研究方法的靈敏度所限，已經檢測不出各實驗組組間的明顯差異；各S1P實驗組Caspase-3蛋白陽性表達與環磷酰胺染毒組相比均有差異，則與上述相關Bcl-2蛋白作用的推論吻合。

綜上，S1P對雄性小鼠的生殖毒性損傷有一定的拮抗作用，S1P能改善因環磷酰胺所致的睪丸組織結構的病理改變，進一步增加精子數量，提高精子的質量；并且，S1P可能通過下調Bax蛋白和上調Bcl-2蛋白表達，抑制Caspases-3的活化，從而使生殖細胞增殖。而S1P作用的具體通路位點以及與其他系統的關聯性，仍有待進一步研究。

(本文圖2見封三)

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Effects of S1P on the apoptins of male mice against the toxicity of cyclophosphamide

LiuDanwei1,PanWei1,XuGuobing2,YangGuozhen1.

1.DepartmentofMedicalLaboratory，GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofMedicalLaboratory,BeijingUniversityCancerHospital，Beijing100142,China.

Objective To study the protective effects of S1P on male mouse reproductive cells by toxicity damage. Methods Forty healthy male Kunming mice were randomly divided into 5 groups (the physiological saline negative control group，the low，middle and high dose group of S1P(0.5, 1.0, 2.0 μg/10 g)，the cyclophosphamide positive control group). Mice in each group were given intraperitoneal injection for 5 days. The mice were killed at the thirtieth day after the first treatment. Testis of the mice was collected and observed pathologic changes of testis by pathological section. And was detected Bcl-2, Bax, Caspase-3 expression by immunehistochemical staining. Results Compared with the positive control group，there were statistical significantly differences in the pathologic changes. The expression of Bcl-2 was improved and the expression of Bax，Caspase-3 were opposite (P<0.05). Conclusion There were some protective effects of S1P on male mouse reproductive cells by toxicity damage. Maybe the mechanism is S1P can inhibit apoptosis protein Bax and excited Bcl-2 to reduce the damage by toxicity.

S1P ； Male mice； Reproductive toxicity； Apoptosis

R114

A

1000-744X(2016)09-0916-03

2016-05-07)

△通信作者，E-mail：yangguozhen-kong@hotmail.com