短小芽孢桿菌實時熒光定量PCR分析中內參基因的篩選

賀婷停 宋婷 王超 張長斌 王海燕

（四川大學生命科學學院，成都 610065）

短小芽孢桿菌實時熒光定量PCR分析中內參基因的篩選

賀婷停 宋婷 王超 張長斌 王海燕

（四川大學生命科學學院，成都 610065）

為了利用熒光定量PCR方法分析短小芽孢桿菌的基因表達水平，需要首先確定適合該菌株的熒光定量PCR分析內參基因。以短小芽孢桿菌的16S rRNA、mecA、cadR、rpoB及sphP 共5個基因作為候選內參基因，利用實時熒光定量PCR的方法分析這5個候選基因在短小芽孢桿菌發酵培養不同時間點的表達情況，再用geNorm和NormFinder 軟件評估它們的表達穩定性。結果顯示，利用geNorm軟件分析得出16S rRNA和mecA是表達最穩定的基因，最適內參基因數為2。NormFindr軟件分析得出mecA為最穩定的基因。對短小芽孢桿菌3個功能基因的差異表達分析結果表明，16S rRNA和mecA都是合適的內參基因，而mecA基因由于表達豐度適中，更適合于作為內參基因研究結構基因的表達。為了得到更準確的差異表達結果，也可用兩個基因同時進行校正。

短小芽孢桿菌；實時熒光定量PCR；內參基因；geNorm；NormFinder

近年來，實時熒光定量 PCR 技術已被廣泛應用于不同生物基因表達的絕對定量和相對定量研究，這項技術因具有高靈敏性、高效性、準確性和重復性好等特點，已成為分子生物學研究領域基因表達分析的重要方法之一，被大量用于分析基因在不同發育時期以及經過不同處理的樣本間的表達差異等［1］。

有效的實時熒光定量PCR分析取決于很多因素，如提取的RNA的質量、反轉錄的效率、引物特異性以及數據處理方法等［2］，而采用穩定表達的內參基因來控制實驗誤差也是非常重要的。理想的內參基因應該是在各種類型的組織、細胞和不同的實驗因素條件下均能恒定表達。在真核生物中已經鑒定出一些表達相對穩定的內參基因用于定量表達分析，如廣泛使用的β-actin和GAPDH［3］，但在原核生物中還沒有找到廣泛穩定表達的內參基因。大量的研究結果表明，任何一種管家基因的所謂恒定表達都只是在一定類型的細胞或實驗因素作用下“有范圍”的恒定，并沒有表達絕對穩定的基因［4］。Sun等［5］研究了18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin 4個內參基因在茶樹中的表達穩定性，發現在不同成熟度的葉片和愈傷組織中表達最穩定的是GAPDH基因，在不同組織器官中表達最穩定的基因則是β-actin。在細菌的基因差異表達分析中，23S rRNA和16S rRNA［6，7］是經常使用的定量PCR的內參基因，但有研究表明核糖體RNA的表達水平高度依賴于細菌細胞的生理狀態，當細胞處于熱激、營養匱乏或生長速率發生改變的條件下，核糖體RNA的表達水平發生改變［8，9］，有研究表明，大腸桿菌在碳源［10-12］或無機離子［10，11］饑餓情況下，16S rRNA發生降解。因此，研究不同的實驗材料和不同的實驗條件下目標基因的表達時，有必要對內參基因進行重新篩選，并且隨著對定量要求的不斷提高，為了得到更可靠的實驗結果，實驗中可選擇1個或多個內參基因進行校正［12，13］。

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）是一種廣泛存在的土壤細菌，在許多生物技術領域有重要的用途：如工業化生產胞外堿性蛋白酶、拮抗植物病源菌等。開展短小芽孢桿菌的基因表達研究，不僅可以豐富芽孢桿菌的基因表達調控理論，也可為菌株的開發和利用提供重要的指導。要精確分析短小芽孢桿菌的基因表達情況，確定合適的內參基因是前提，但國內外還未見關于其內參基因篩選的報道。為了確定短小芽孢桿菌熒光定量PCR分析的內參基因，我們選擇了細菌定量PCR分析中常用的內參基因16S rRNA和rpoB［14-16］，以及我們從短小芽孢桿菌SCU11轉錄組測序數據庫中篩選出的3個穩定表達基因（mecA、cadR和sphP），針對短小芽孢桿菌發酵產生堿性蛋白酶的培養過程，采用 geNorm［13］和NormFinder［17］軟件對這5個基因的表達情況進行穩定性分析，以期選擇出最適于短小芽孢桿菌基因表達水平研究的內參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）SCU11為本實驗室分離并誘變得到的一株高產堿性蛋白酶的菌株。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與發酵培養 將保存的菌種接種于LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。活化的菌液以4%的接種量轉種于發酵培養基（麩皮2.5%、黃豆粉2%、酵母膏0.3%、K2HPO40.4%、NaH2PO40.04%及CaCO30.3%），轉速200 r/min，溫度34℃，在發酵培養的不同時間取樣。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 在菌株生長的不同時期，對應于發酵過程的發酵前期（0 h）、遲緩期（2 h）、對數期（6 h）、轉換期（12 h和14 h）、穩定期（24 h）、衰退期（36 h）、酶活最高點（48 h）、酶活下降點（60 h）取樣，離心收集菌體，液氮冷凍后于-80℃保存。凍存的菌體取出后加入15 mg/mL的溶菌酶在37℃下溫浴10 min，利用TRIzol?Reagent（Life Technologies）提取樣品總RNA。RNA的濃度采用Thermos 公司的Nanodrop-2000測定，RNA的完整性通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

利用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒（TaKaRa Biotechnology，Japan）進行反轉錄，得到的cDNA于-20℃保存，用于熒光定量PCR分析。為了驗證RNA樣品中是否存在基因組DNA的污染，從反轉錄之前的反應體系中取出1 μL作為模板進行PCR驗證，沒有擴增出條帶，說明基因組DNA去除完全。

1.2.3 候選內參基因的選擇與引物設 本研究選擇了5個基因進行比較分析：16S rRNA、mecA、rpoB、cadR和sphP。其中16S rRNA和rpoB是常用的細菌看家基因，mecA、cadR、sphP是我們根據短小芽孢桿菌SCU11轉錄組數據（結果待發表）中基因的RPKM值篩選而來：利用RPKM值計算變異系數CV（標準差與平均值的比值）和最大折疊倍數MFC（最大的RPKM值與最小的RPKM值的比值），選擇CV值小于4%且MFC值小于2的基因［18］。依據NCBI中短小芽孢桿菌BA06（SCU11的原始野生菌株）基因組中相應基因序列，使用 Primer 5軟件設計引物，由成都擎科梓熙生物科技有限公司合成。引物序列，見表1。

表1 短小芽孢桿菌實時熒光定量PCR分析的基因引物序列

1.2.4 內參基因熒光定量PCR分析 采用 TaKaRa公司的 SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量 PCR 試劑盒和 Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR儀進行，PCR反應體系為：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL；cDNA template 2 μL；引物（0.4 μmol/L）各0.5 μL；水7 μL。PCR擴增條件為：95℃ 1 min；95℃ 5 s，52.5℃ 30 s，72℃ 30 s（在延伸階段檢測熒光強度，收集信號），40個循環；72℃ 10 s。熔解曲線：加熱樣品從65-95℃，每隔 0.5℃停留1 s檢測1次熒光強度變化。

引物擴增效率驗證和標準曲線的繪制：引物擴增效率（E）與標準曲線的斜率K相關，計算方程式為：E=（10-（1/K）-1）× 100%；制作標準曲線時，將第1鏈cDNA模板依次稀釋5個梯度（1/5、1/25、1/125、1/625和1/3125），研究5個內參基因在發酵的9個不同時間點的表達豐度，每個反應重復3次。解鏈溫度等系列參數通過Bio-Rad CFX 熒光定量PCR 儀自動獲得。

1.2.5 數據處理和分析 以不同發酵時間點的cDNA稀釋液作為實時熒光定量PCR的反應模板，反應體系和條件與標準曲線反應體系相同。將獲得的Ct值輸入geNorm程序運行，該程序能夠計算出每個候選內參基因表達穩定度的平均值（M）并且根據M值的大小進行排序，M值越小，表達就越穩定，從而選出最優內參基因，再通過內參基因的標準化因子的配對差異分析（Vn/n+1）判定內參基因的最適數目。同時利用 NormFinder 程序選出最穩定的基因，二者結合確定最合適的內參基因用于后續實驗對目的基因的分析。

1.2.6 目的基因的相對表達分析 以mecA和16S rRNA分別作為內參基因，以6 h基因的表達量為校準樣本（calibrator），12、24、36、48和60 h的表達量為實驗樣本（sample），采用2-ΔΔCt相對定量法分析spo0A、sinR和RNA_F_101三個基因的相對表達量。方法如下：

實驗樣本的△Ct值：△Ct1=Ctsample-Ctref；校準樣本的△Ct 值：△Ct2= Ctcalibrator-Ctref；其次，用校準樣本的△Ct 值歸一試驗樣本的△Ct 值：△△Ct=△Ct1-△Ct2；最后，計算表達水平比率：表達量的比值=2-ΔΔCt。

2 結果

2.1 菌體培養及RNA提取

在短小芽孢桿菌蛋白酶發酵培養的不同生長時期（0、2、6、12、14、24、36、48和60 h），分別收集菌體采用Trizol法提取RNA。提取的RNA經Nanodrop-2000紫外分光光度計檢測濃度和純度，所有樣品的 OD260/OD280的比值均在2.0左右，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，23S和16S條帶亮度清晰（圖1），說明RNA完整性較好。提取的RNA樣品再進行去基因組DNA處理，PCR檢測表明樣品中基因組DNA去除完全。將去除基因組DNA的RNA用于后續的反轉錄及實時熒光定量 PCR。

圖1 短小芽孢桿菌SCU11總RNA電泳圖譜

2.2 引物擴增效率及特異性

以梯度稀釋的cDNA樣本作為模板進行PCR擴增，繪制5個候選內參基因（mecA、rpoB、cadR、sphP、16S rRNA）的標準曲線，得到引物的相關參數（表2）。表2顯示，5個候選內參基因的線性相關系數（R2）變化范圍為0.992-0.997，顯示出較好的線性關系。同時根據E =（10-1/slope-1）× 100計算擴增效率，這5個候選內參基因均表現出良好的擴增效率（均大于90%），說明定量結果準確、可靠，符合實時熒光定量PCR對擴增效率的要求。從5個候選內參基因的熔解曲線看（圖2），都只出現單一的信號峰，說明沒有引物二聚體和非特異性條帶產生。為了進一步證實5個候選內參基因的擴增特異性，將擴增片段經2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果（圖3）顯示每對引物均擴增出預期大小的片段，且沒有出現引物二聚體和非特異性擴增條帶，說明引物的特異性較好。

表2 短小芽孢桿菌實時熒光定量PCR候選內參基因的擴增參數

根據5個候選內參基因在不同時間點的平均Ct值（圖4）可以看出，在發酵培養的不同時期5個候選內參基因的表達水平都有一定的變化；其中16S rRNA 作為傳統內參基因的表達豐度相對較高，而sphP表達豐度最低。

2.3 內參基因的表達穩定分析

圖2 候選內參基因的熔解曲線

通過geNorm軟件評估5個候選內參基因在短小芽孢桿菌SCU11不同發酵時期的表達穩定性（M），該軟件默認的穩定性值M=1.5，基因的表達穩定值M越小，表明穩定性越高。根據geGorm軟件計算，短小芽孢桿菌中5個內參基因在發酵不同生長時期的表達穩定值M排列順序為sphP（0.099）＞ rpoB（0.081）＞ cdaR（0.072）＞mecA= 16S rRNA（0.060）（圖5），說明表達最穩定的基因是16S rRNA和mecA。

圖3 候選內參基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

圖4 五個候選內參基因在發酵不同時期的表達豐度Ct值

圖5 geNorm軟件分析各內參基因的表達穩定值M

在基因的表達分析中，有時需要使用2個或2個以上的內參基因對目的基因進行校正以減少實驗誤差，從而得到更加準確的結果。利用geNorm程序分析了內參基因的配對差異值 Vn/n + 1，結果（圖6）顯示V2/3值為0.024，小于程序推薦值0.15，即無需加入第3個基因進行校正，最合適的內參基因數目是2個，分別是表達最為穩定的mecA和16S rRNA。

圖6 geNorm軟件分析確定用作校準的最適內參基因的數目

進一步使用NormFinder軟件對5個內參基因的表達穩定性進行了分析，M值越小基因表達就越穩定。通過 NormFinder 程序分析熒光定量數據得出每個基因的表達穩定值（M），同時還提供當使用此基因校正時所引用的系統誤差值（表3）。M值的大小順序為cadR（0.113）＞rpoB（0.077）＞sphP（0.073）＞16SrRNA（0.021）＞mecA（0.019）。結果表明，mec-A的M值最小，是表達最穩定的基因。

表3 NormFinder軟件分析各內參基因的表達穩定值

2.4 目的基因差異表達分析

根據上述的實驗結果，在短小芽孢桿菌發酵培養過程中，geNorm軟件分析得出16S rRNA和mecA的穩定性最高。NormFinder軟件分析的穩定性最高的內參基因是mecA。為了對這兩個基因作為熒光定量PCR分析內參基因的可靠性和適應性進行驗證，選擇sinR、spo0A和RNA_F_101三個基因進行差異表達分析。

結果（表4）顯示，針對我們的cDNA樣本，候選內參基因16S rRNA的Ct值在10-13之間，而mecA基因的Ct值在24-26，表明16S rRNA基因的表達水平大大高于mecA基因。從3個目的基因的表達水平以及我們的轉錄組數據分析來看，絕大多數基因的表達水平更接近于mecA。

表4 短小芽孢桿菌SCU11候選內參基因與目的基因不同時間點的平均Ct值

分別以mecA和16S rRNA為內參基因，6 h為對照樣本，采用2-ΔΔCt相對定量法得出目的基因的相對表達量（表5）。從表中的數據可以看出，作為一個轉錄調控因子，sinR在整個發酵過程的表達水平相對比較穩定。另外兩個基因RNA_F_101和spo0A，分別用兩個內參基因計算出的目的基因表達水平，雖然具體的變化倍數略有變化，但趨勢完全一致，說明mecA和16S rRNA基因均可以作為短小芽孢桿菌熒光定量PCR分析的內參基因。

3 討論

近年來，隨著轉錄組測序、基因表達譜芯片等的迅速發展，實時熒光定量PCR已經成為驗證基因表達水平變化的重要技術手段，而選擇合適的內參基因做校正是很關鍵的。理想的內參基因一般應該滿足：選擇的內參基因不能為假基因［19］；在不同的發育階段及脅迫條件下表達穩定；表達水平與目標基因相近。然而，不同物種不同生理條件下使用的內參基因各不相同，即使廣泛使用的內參基因Actin和 GAPDH在不同的條件下其表達也會發生改變或受到其他基因的調控［20-23］。因此，研究者需要根據不同的實驗條件篩選不同的內參基因。

為了減少選擇內參基因的誤差，本研究采用了兩種不同卻又互補的軟件進行分析：geNorm和NormFinder，這兩種軟件被廣泛的應用于熒光定量PCR 中候選內參基因的穩定性評價［24，25］。geNorm軟件是根據候選基因中表達量最高的內參基因與其他候選基因的配對表達水平比值經對數變換，計算其標準差作為基因表達穩定值M，其可以對多個管家基因同時進行比較篩選，選出兩個及以上的內參基因，有助于減小系統誤差，得到更準確的結果，尤其是對微小表達差異的基因的表達研究具有重要的意義。當然，目的基因有較大表達差異時則不必選擇較多的內參基因，這需要視具體實驗要求及實驗條件而定。NormFinder軟件也是常用的一種評估基因表達穩定性的方法，原始數據經△Ct法將其轉換成線性表達量，然后通過方差分析得出基因的表達穩定值M，它可以平衡兩個變異的來源，但它不能忽略樣品制備過程中的系統誤差，然而統計方法可以通過大量數據處理來克服這一缺點，所以當不能明確地細分樣品時，可以選擇這種方法。

表5 短小芽孢桿菌SCU11各目的基因不同時間點的相對表達量

目前，國內外還沒有對短小芽孢桿菌內參基因篩選及評價的文獻報道。在研究短小芽孢桿菌基因表達分析時，應首先考慮選擇與目的基因表達水平較為接近的內參基因作為參比。實驗利用geNorm和NormFinder兩個軟件篩選出兩個比較穩定的候選內參基因：mecA和16S rRNA。同時，利用這兩個候選內參基因對sinR、spo0A和RNA_F_101的表達量進行了分析。sinR基因是一種DNA結合蛋白，它不僅是蛋白酶基因的負調控因子，還參與芽孢生成、鞭毛基因、自溶素生產和感受態的形成等多種細胞內部調控作用［26］。Spo0A是磷酸激活應答調控蛋白家族的成員之一［27］，在孢子的初始形成階段起主要的調控功能。RNA_F_101是我們從短小芽胞桿菌轉錄組數據庫（待發表）中預測出的功能未知的差異表達非編碼RNA。結果表明這兩個內參基因計算出的3個目的基因的表達水平的變化趨勢是完全一致的，說明16S rRNA和mecA都可以作為短小芽孢桿菌熒光定量PCR分析的內參基因。但是，需要注意的是，雖然16S rRNA有較高的表達穩定性，但是由于16S rRNA具有很高的表達水平，其表達量通常顯著高于細胞內絕大多數結構基因。在熒光定量PCR實驗中，基線通常是3-15個循環的熒光信號，是由于測量的偶然誤差引起的，因此，對熒光定量的結果一般取Ct值在15-35個循環的數據進行分析，太大或太小都會導致定量的不準確。在表4的實驗中，16S rRNA的Ct值在11-12左右，如果降低模板濃度將16S rRNA的Ct值控制在理想的15-35個循環之間，目的基因RNA_F_101的Ct值就會大于35個循環，導致結果難以分析。從我們所做的20多個結構基因的熒光定量PCR分析結果以及轉錄組數據結果來看，大多數基因的表達量都顯著低于16S rRNA基因，因此，需要使用一個表達豐度較低的內參基因，mecA就是一個合適的基因。MecA屬于MecA 家族蛋白的成員之一，是ClpC六聚體形成及其進一步激活的重要的接頭蛋白。當MecA過表達時，會抑制孢子的形成，是孢子形成的負調控因子［28-30］。通過3個功能基因的差異表達分析進行了驗證。結果表明16S rRNA和mecA都可以作為研究短小芽孢桿菌基因表達分析的內參基因，mecA基因由于表達豐度適中，更適合于作為內參基因研究結構基因的表達。為了得到更準確的差異表達結果，也可用兩個基因同時進行校正。

4 結論

本研究通過geNorm和Normfinder軟件對5個熒光定量PCR分析的候選內參基因在短小芽孢桿菌的表達穩定性進行了評估，篩選出穩定的內參基因并

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（責任編輯 狄艷紅）

Screening of Reference Genes in Bacillus pumilus by Real-time Fluorescence Quantitative PCR

HE Ting-ting SONG Ting WANG Chao ZHANG Chang-bin WANG Hai-yan
（College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610065）

In order to study the gene expression in Bacillus pumilus through real-time fluorescence quantitative PCR，we need to determine the appropriate reference gene firstly. The expressions of five candidate reference genes（16S rRNA，mecA，cadR，rpoB，and sphP）under different fermentation phases of B. pumilus were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR，and their expression stabilities were evaluated by geNorm and NormFinder software. According to the analysis by geNorm software，16S rRNA and mecA were the most stable genes and the number of optimal reference genes were 2. Analysis by NormFinder software revealed that mecA was the most stable gene. The differential expressions of 3 functional genes of B. pumilus indicated that 16S rRNA and mecA were appropriate reference genes，moreover，expression abundance of mecA was moderate，thus it was more suitable to be used as a reference gene in studying structural gene. Additionally，2 reference genes can also be used for calibration in order to acquire more accurate results.

Bacillus pumilus；real-time fluorescence quantitative PCR；reference gene；geNorm；NormFinder

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.028

2016-03-31

國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）（2012AA022204）

賀婷停，女，碩士研究生，研究方向：分子進化；E-mail：305795664@qq.com

王海燕，女，副教授，碩士生導師，研究方向：分子遺傳學及基因工程；E-mail：hayawang@scu.edu.cn