CKS1B參與擬穴青蟹性腺發育的研究

韓坤煌戴燕彬鄒志華張子平王藝磊

（1. 集美大學水產學院 農業部東海海水健康養殖重點實驗室，廈門 361021；2. 寧德市富發水產有限公司，寧德 352103；3. 漳州市水產技術推廣站，漳州 363000；4. 福建農林大學動物科學學院，福州 350002）

CKS1B參與擬穴青蟹性腺發育的研究

韓坤煌1，2戴燕彬3鄒志華1張子平4王藝磊1

（1. 集美大學水產學院 農業部東海海水健康養殖重點實驗室，廈門 361021；2. 寧德市富發水產有限公司，寧德 352103；3. 漳州市水產技術推廣站，漳州 363000；4. 福建農林大學動物科學學院，福州 350002）

CDC28蛋白激酶調節亞基1B（CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B，CKS1B）是高度保守的CKS1家族成員之一，在細胞周期中作為細胞周期蛋白激酶的調節亞基參與調控真核生物的細胞分裂。因此，研究CKS1家族基因參與甲殼動物性腺發育調節的分子機制具有重要的意義。從已構建的擬穴青蟹性腺EST數據庫中篩選到CKS1B基因片段，繼而克隆出其全長cDNA序列（Sp-CKS1B），并利用qRT-PCR技術檢測其在不同組織和性腺不同發育階段中的差異表達。結果顯示，獲得Sp-CKS1B的全長cDNA序列722 bp，其中5' UTR為82 bp，3' UTR為379 bp，開放閱讀框261 bp，編碼86個氨基酸，包含一段典型的CKS保守序列，屬于CKS家族蛋白。在不同組織qRT-PCR結果顯示，Sp-CKS1B 基因在O5期雌蟹卵巢中的表達水平最高，并與其他組織具有極顯著差異（P＜0.01）；同時，在性腺不同發育階段的表達結果顯示，Sp-CKS1B 基因在精巢T1期的表達量最高，其次為O5期，二者顯著高于卵巢O1-O4期的表達水平（P＜0.05）；而在精巢T3期的表達量最低，并顯著低于T1、T2以及卵巢O4、O5期的表達水平（P＜0.05）。結果說明了Sp-CKS1B在擬穴青蟹的性腺發育過程中可能具有十分重要的作用。

CDC28蛋白激酶調節亞基1B；擬穴青蟹；基因克隆；組織表達；性腺發育

細胞周期是細胞生命活動的重要特征之一，受到細胞周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）等因子的調控，而CDKs的活性受到細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDK inhibitor，CKI）、細胞周期蛋白激酶活化激酶（CDK activating kinase，CAK）以及細胞周期蛋白依賴性激酶調節亞基（Cyclin kinase subunit，CKS）的調控［1］。CKS1是細胞周期調節蛋白CKS/Suc1家族成員之一，在序列上高度保守，在細胞周期中通過與CDKs結合參與調控真核生物的細胞分裂［2］。CDC28蛋白激酶調節亞基1B（CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B，CKS1B）是CKS1家族成員之一，在細胞周期中參與組成泛素連接酶SCFSKP2-CKS1復合物，進行泛素化降解細胞周期蛋白抑制因子p27kip1，使細胞周期從G1期順利向S期轉換，為后續細胞分裂做準備［3，4］。Reynard等［5］研究表明CKS1在細胞分裂G1期和M期均具有重要作用。Westbrook等［6］在CKS1參與乳腺癌細胞調控機制的研究中發現，減少雌激素的分泌會導致CKS1表達水平降低，而使癌細胞停滯于G1期，進一步敲除CKS1基因后，CDK1的表達亦相應減少，使細胞分裂難以進入M期。Demetrick等［7］研究表明CKS1在生殖細胞減數分裂第一次分裂中期向后期轉換過程中具有重要的作用。因此，CKS1是細胞有絲分裂和減數分裂的一個重要的調節因子。

目前關于甲殼動物生殖內分泌調節系統的研究已發展成為其內分泌學研究的一個學術熱點。擬穴青蟹（Scylla paramamosain）是我國東南沿海的一種重要的經濟養殖蟹類，與其他蟹類相比，具有個體較大、生長較快、肉鮮味美、營養價值高等特點，深受廣大消費者喜愛，在我國水產養殖中具有重要的地位［8］。目前研究擬穴青蟹性腺發育的調控機制已深入到分子水平，而關于CKS1在甲殼動物性腺發育中的研究尚未見到報道。因此，本研究首次在甲殼動物中成功克隆出擬穴青蟹CKS1B（命名為Sp-CKS1B）基因的全長cDNA序列［9］，并檢測其在不同組織以及性腺發育過程中的差異表達，以期在分子水平上為研究CKS1家族基因參與甲殼動物性腺發育的調控機制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

所用擬穴青蟹采自廈門農貿市場，結合性腺的外部形態、性腺發育指數［10］及組織學特征［11，12］，將卵巢分為5個時期，精巢分為3個時期，每個性腺發育時期的個體數選取3只以上，并選取5只以上O5期雌蟹個體的組織用于測定組織差異表達分析。

1.2 方法

利用RDP試劑［13］及RNA提取方法提取擬穴青蟹各樣品總RNA。根據前期獲得的Sp-CKS1B基因片段，利用Primer5.0軟件，設計其5' RACE和3' RACE引物，克隆全長cDNA序列，采用NCBI數據庫中VecScreen、Blast、ORF Finder以及PI、SWISS-MODEL、MEGA 4.0等軟件對其序列進行生物信息學分析。以隨機引物介導合成反轉錄cDNA第一條鏈，以18S rRNA［14］為參照基因，采用qRTPCR技術，檢測其在不同組織及性腺不同發育階段的表達水平。

1.3 數據分析

根據qRT-PCR技術所得的RQ值，利用SPSS 15.0軟件對其進行樣本T-檢驗分析，所用數據用平均值±標準誤（x-±s）來表示，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結果

2.1 Sp-CKS1B全長cDNA的克隆與序列分析

以擬穴青蟹的性腺EST［15］文庫篩選到的CKS1B基因片段為基礎，通過SMART-RACE技術成功克隆出Sp-CKS1B基因的全長cDNA序列，基因登錄號為FJ623275。如圖1所示，Sp-CKS1B的全長cDNA序列722 bp，其中5' UTR為82 bp，3' UTR為379 bp，開放閱讀框261 bp編碼86個氨基酸。推導的蛋白分子量為10.5 kD，pI 6.27。BLAST比對結果顯示，其與大多數物種的CKS1具有70%以上的一致性，結構域分析顯示其包含典型的CKS保守序列（I5-T73），屬于CKS1家族蛋白。

2.2 Sp-CKS1B系統進化樹分析

根據NCBI數據庫中不同物種的CKS1B蛋白序列，以Mega 4.0軟件的鄰接法將擬穴青蟹Sp-CKS1B推導的氨基酸序列與其他物種的CKS1B氨基酸序列進行多重比對，構建Sp-CKS1B系統進化樹。結果（圖2）顯示，脊椎動物、脊索動物、甲殼類、昆蟲類各自形成一簇，綠藻（Ostreococcus tauri）處于系統進化樹的最外圍，擬穴青蟹Sp-CKS1B與淡水甲殼動物大型溞（Daphnia magna）聚為一枝，位于脊椎動物、脊索動物、昆蟲類的中間。

圖1 擬穴青蟹CKS1B cDNA及其氨基酸序列

2.3 Sp-CKS1B 基因在不同組織中的表達

利用qRT-PCR技術得出的組織差異表達結果（圖3）顯示，Sp-CKS1B 基因在O5期雌蟹卵巢中的表達水平最高，并與其他各組織的表達水平具有極顯著差異（P＜0.01），其次為血淋巴、胃以及眼柄中的表達，表達最低值出現在肝胰腺。卵巢以外其他各組織間的表達無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 Sp-CKS1B 基因在性腺發育中的表達

如圖4所示，在擬穴青蟹性腺的不同發育階段中，Sp-CKS1B 基因在精巢T3期的表達量最低，并顯著低于T1、T2以及卵巢O4、O5期的表達水平（P＜0.05）；而在精巢T1期的表達量最高，O5期的表達水平緊隨其后，二者與卵巢O1-O4期的表達水平具有顯著性差異（P＜0.05）；O1-O3期以及T3期之間的表達水平無明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

圖2 基于鄰位相接法構建的系統進化樹

細胞周期是細胞生命活動的基本形式，通過對細胞周期調控因子的深入研究是目前研究配子細胞的發生與成熟的一大熱點。CKS1是一種序列高度保守的細胞周期調節蛋白，屬于CKS/Suc1家族［16］，作為CDKs的調節亞基，為CDKs功能活性所必須，在細胞周期過程中起著重要的調控作用。CKS1B是CKS1的家族成員之一，主要參與合成泛素連接酶SCFSKP2-CKS1復合物，對于CDKs的功能抑制因子p27起著泛素化降解作用，從而促進細胞周期順利進入S期［3，4］，為后續細胞分裂周期做準備。對不同物種CKS1B的序列與結構進行分析有助于更好地了解其功能的作用機制。本研究首次在甲殼動物中克隆出Sp-CKS1B的全長cDNA序列，通過比對分析顯示其序列中包含1個典型的CKS保守區域（I5-T73），屬于CKS1家族成員，其序列中存在一個高度保守的“HXPEPH”序列的β區域，該區域決定CKS蛋白的折疊方式［9］。Richardson等［17］率先從人的身上克隆出CKS1基因，其研究表明CKS1從酵母到人的一致性較高，高達81%，Bourne等［18］研究結果表明大部分物種的CKS1蛋白分子結構也存在較高的相似性。本研究通過對Sp-CKS1B的序列進行BLAST比對分析，結果顯示其序列在不同物種中高度保守，與大部分物種的CKS1均有70%以上的一致性，特別是與淡水甲殼動物大型溞（Daphnia magna）CKS1的一致性最高，達88%，而與人的CKS1B序列（基因登錄號：EU176487.1）一致性亦為79%，序列與結構的高度保守反映了其在細胞周期過程中可能具有相似且十分重要的生物學功能。

圖3 Sp-CKS1B基因在O5期雌蟹不同組織間的表達

圖4 Sp-CKS1B基因在性腺發育各時期的表達

CKS在細胞周期中的調節作用已被廣大研究者所熟知［19-21］，高等真核生物的CKS家族有2個成員：CKS1和CKS2，它們都是通過結合CDKs促進CDKs功能活性，從而參與調控細胞周期［22］。本研究對Sp-CKS1B在O5期雌蟹不同組織間的表達水平結果（圖3）顯示，Sp-CKS1B基因在卵巢中的表達量最高，并與其他各組織具有極顯著差異（P＜0.01），這與前期關于Sp-Ub［10］、Sp-SUMO1［12］、Sp-CDK1［14］等細胞周期相關蛋白基因在擬穴青蟹不同組織間的差異表達相一致，研究表明細胞周期相關激酶CDK1和泛素降解系統相關Ub以及SUMO基因在擬穴青蟹卵巢中的表達極顯著高于其他各組織。CDK1是細胞分裂過程中G1/S期以及G2/M期轉換的重要調節因子［23，24］，泛素蛋白酶體降解途徑（UPP）是真核生物細胞內的一種重要的蛋白降解途徑，細胞中有超過80%的蛋白須通過UPP進行降解以完成細胞分裂［1］，Sp-CKS1B與這些基因在卵巢中相同模式的高表達，可能是由于O5期卵巢中的細胞分裂次數較多，且臨近排卵期，卵母細胞不斷成熟、體積不斷膨脹［11］，可能需要活化眾多的CDKs和降解細胞周期相關蛋白以完成細胞分裂，因而它的表達水平相比其他組織處于較高的水平。

進一步，本研究通過對擬穴青蟹性腺不同發育時期Sp-CKS1B的差異表達結果（圖4）發現，Sp-CKS1B在性腺各個時期均有表達，其表達值最高出現在精巢T1期，其次為O5期，二者與卵巢O1-O4期的表達水平具有顯著性差異（P＜0.05）；而在精巢T3期的表達量最低，并與精巢T1、T2期以及卵巢O4、O5期的表達水平具有顯著性差異（P＜0.05）。其中Sp-CKS1B在卵巢中的表達呈一定的梯度增加現象，而在精巢的表達卻呈相反趨勢，可能是由卵巢［11］和精巢［25，26］發育調節機制的差異引起。在卵巢發育過程中，Sp-CKS1B在O1-O4期的表達未有顯著性差異，至O5期達到最高值，并與O1-O3期具有顯著性差異，這與Sp-CDK1［14］在擬穴青蟹卵巢中的表達有所區別，而與Sp-Ub［10］的表達模式一致。CDK1在細胞周期各時相轉換過程中均有普遍功能，CDK1/cyclinA結合可使細胞順利通過G2期，并參與了G2/M期的過渡期，CDK1/cyclinB復合物可促進細胞進出M期［1，23，24］，其在卵巢中的表達具有較為廣泛的分布；Ub是真核細胞中普遍存在的小分子蛋白，參與了細胞內絕大多數的泛素化降解［1］。Sp-CKS1B的表達并不僅僅作用于CDK1，其在卵子發生中后期顯著提高可能是由于擬穴青蟹卵巢發育過程中，其卵子細胞不斷增多，細胞分裂旺盛，成熟卵黃蛋白積累增加［27，28］，促進其細胞直徑也不斷膨脹［11］，所需的CKS亦會相應增加，故而其表達量會有所增加。

本研究中Sp-CKS1B在精巢發育過程中呈現遞減趨勢，與Sp-CDK1［14］和Sp-Ub［10］的表達模式相似。Spruck等［29］對小鼠生殖細胞發生過程的調控機制研究中發現，如缺失CKS2基因將導致減數分裂Ⅰ期難以向后期轉換；Tang等［30］研究發現CDK偶聯的CKS1在G1和G2期均發揮著重要的作用；Reynard等［5］的研究發現，芽殖酵母Cks1可促進細胞周期G1期與M期中的CDKs-cyclins復合物功能活性的激活；Rother等［31］的研究結果發現Cks1在晚G1期開始表達，至S/G2期達到最高；Krishnan等［32］通過氟西汀處理腫瘤細胞的研究發現CKS1與cyclinA的表達水平具有同步下調現象，使腫瘤細胞停滯于G0/G1期，這些研究成果為進一步解釋Sp-CKS1B在精巢中的差異表達提供了理論依據。本研究結果中Sp-CKS1B在精巢T1期的表達水平最高，在T3期的表達量最低，可能是由于精巢發育過程中，前期T1-T2期精原細胞不斷變態發育為精子細胞，生精細胞的細胞分裂旺盛，CKS1B的表達量增高可促進更多的CDKs/cyclins復合物功能的活化［5，6］，并促進眾多蛋白通過泛素化途徑降解［2，3］，促進細胞分裂次數急劇增加，因而導致表達量增多；而T3期的成熟細胞數量不斷增多，形成了較多的生殖帶［25，26］，處于細胞分裂周期中的細胞比例較少，因而其表達水平最低。

4 結論

本研究首次克隆出擬穴青蟹Sp-CKS1B的全長cDNA序列，BLAST比對拼接顯示其序列具有保守的CKS結構域，屬于CKS1家族。通過對其在不同組織以及性腺不同發育階段的差異表達研究表明，Sp-CKS1B在卵巢中的表達量最高，并與其他組織具有極顯著差異；而在性腺不同發育階段的表達分布并不一致，顯示Sp-CKS1B對擬穴青蟹性腺發育及生殖細胞的發生與成熟具有重要的調節作用。

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（責任編輯 狄艷紅）

On the Involvement of CKS1B in Gonad Development of Mud Crab Scylla paramamosain

HAN Kun-huang1，2DAI Yan-bin3ZOU Zhi-hua1ZHANG Zi-ping4WANG Yi-lei1
（1. Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture，Fisheries College，Jimei University，Xiamen 361021；2. Ningde Fufa Fisheries Company Limited，Ningde 352103；3. Fisheries Technical Extension Station of Zhangzhou，Zhangzhou 363000；4. College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002）

CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B（CKS1B）is a member of the highly conserved cyclin kinase subunit 1（CKS1）protein family，and involves in cell division of eukaryotic organisms as a regulatory subunit of cyclin-dependent kinases. Therefore，it is of significance to study the function of CKS1 family genes involved in the molecular mechanism of regulating crustacean’s gonad development. In the present study，the fragment of CKS1B gene was selected from the gonad EST library of S. paramamosain，and the full-length cDNA sequence of Sp-CKS1B was cloned，further the expressions of Sp-CKS1B in different tissues and different development stages of gonad were examined using qRT-PCR. As results，the full length cDNA of Sp-CKS1B was 722 bp，including a 5'untranslated region（5' UTR）of 82 bp，a 3'UTR of 379 bp，and an open reading frame of 261 bp encoding a protein of 86 amino acid. The protein contained a typical CKS conservative sequence belonging to the CKS family. Its expression level in the ovary of O5 stage female crabs was the highest，and presented extremely significant difference from other tissues（P＜0.01）. Meanwhile，the expression level of Sp-CKS1B gene in T1 was the highest among the other stages of gonad development，followed by O5 stage，both of them were significantly higher than O1-O4 stage of female with significant difference（P＜0.05）. Its lowest expression level was in the T3 stage，which was significantly lower than in T1，T2，O4，and O5 stages（P＜0.05）. These results suggest that Sp-CKS1B may play a critical role in the gonad development of the mud crab.

CKS1B；Scylla paramamosain；gene cloning；tissue expression；gonad development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.030

2016-05-20

國家自然科學基金項目（31072200，31472266），集美大學創新團隊基金項目（2010A001）

韓坤煌，男，博士研究生，研究方向：水產動物增養殖技術、功能基因組學；E-mail：hankunhuang@foxmail.com

王藝磊，女，教授，博士生導師，研究方向：水產動物功能基因組學；E-mail：ylwang@jmu.edu.cn