曼陀羅子對小鼠L5178Y細胞TK基因的致突變作用

彭曉明，霍仕霞，高 莉，閆 明

（新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所·新疆維吾爾醫方劑學實驗室，新疆 烏魯木齊 830049）

曼陀羅子對小鼠L5178Y細胞TK基因的致突變作用

彭曉明，霍仕霞，高 莉，閆 明

（新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所·新疆維吾爾醫方劑學實驗室，新疆 烏魯木齊 830049）

目的 研究曼陀羅子對小鼠淋巴瘤L5178Y細胞TK基因的致突變作用。方法 將培養的小鼠淋巴瘤L5178Y細胞在代謝活化和非代謝活化條件下，分別以62.5，125，250，500 g/mL的曼陀羅總堿或625，1 250，2 500，5 000 g/mL的氫溴酸東莨菪堿處理3 h后，棄細胞上清液，并加入DMEM培養基繼續培養48 h。然后將細胞接種于含三氟胸苷的96孔板，計數各組的突變細胞集落數。結果 與對照組比較，在代謝活化和非代謝活化條件下，62.5，125，250，500 g/mL的曼陀羅總堿和625，1 250，2 500，5 000 g/mL的氫溴酸東莨菪堿均未見誘導L5178Y細胞突變率的增加。結論 62.5～500 g/mL的曼陀羅子總堿和625～5 000 g/mL的氫溴酸東莨菪堿對小鼠L5178Y細胞TK基因無致突變作用。

曼陀羅子；氫溴酸東莨菪堿；淋巴瘤細胞；TK基因；突變

曼陀羅子，維吾爾語名為衣提洋克歐如合，為茄科植物曼陀羅 Datura stramonium L.的干燥成熟種子，是維吾爾醫民間習用藥。該藥具有生干生寒、安神止痛、固澀壯陽、催眠消炎等功能，被廣泛用于治療乃孜樂性感冒、頭痛、風濕關節痛、早泄滑精、失眠、痔瘡、牙周炎等濕熱性或血液質性疾病［1］，但若給藥劑量控制不當易引起中毒反應。課題組前期研究已證實［2-4］，曼陀羅子及其提取物對小鼠肝、腎功能均具有毒性損傷作用，且生藥量超過388 mg/（kg·d）的曼陀羅子提取物亦對Beagle犬的中樞神經系統、血液系統、消化系統、心臟等具有毒性作用。本試驗中通過研究曼陀羅子總生物堿提取物和氫溴酸東莨菪堿對小鼠淋巴瘤L5178Y細胞TK基因是否具有致突變作用，旨在為曼陀羅子的安全應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇凈安泰），37XAY型倒置熒光顯微鏡（上海光學六廠），MCO-18AIC型CO2培養箱（Sanyo），酶標儀（ThermoFisher，Multiskan Go 1510）。1.1.2 試藥

曼陀羅子總生物堿（DTA）由本實驗室自制，制備方法為，曼陀羅子經粗粉后，分別加入5倍、3倍、3倍體積的80%乙醇（pH為3）回流提取3次，每次1 h。提取液過濾濃縮后，加入氨水調節pH至8～9，以1∶1體積比例反復用氯仿萃取至顏色明顯變淺，濃縮冷凍干燥至浸膏，利用酸堿滴定法測定總生物堿含量80%以上。然后稱取0.1 g的DTA，加入200 μL二甲基亞砜（DMSO）超聲溶解，備用。氫溴酸東莨菪堿（SH，批號為LRAA3018）購自Sigma-Aldrich公司。

DMEM（高糖）培養基和馬血清為Gibco公司產品。氨芐青霉素鈉和硫酸鏈霉素購自Amersco公司。DMSO、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、甲基甲烷磺酸乙酯（MMS）、環磷酰胺（CP）均為Sigma-Aldrich公司產品。哺乳動物微粒體酶S9購自上海寶錄生物科技有限公司。

1.1.3 細胞株

小鼠淋巴瘤細胞株L5178Y TK+/-clone（3.7.2c）購自中國科學院細胞庫。

1.2 方法［5］

1.2.1 L5178Y細胞培養及藥物劑量的篩選

L5178Y細胞傳代2～3次后，以1 000 r/min離心收集細胞，DMEM培養基（不含血清）調節細胞濃度至1×106個/mL左右，轉移至96孔培養板，每孔90 μL。然后分別以15.625，31.25，62.5，125，250，500 μg/mL的DTA及10，100，1 000，10 000 μg/mL的SH作用細胞 24 h。藥物作用完成后，每孔加入 5 g/L的 MTT 10 μL，作用4 h后，每孔加入100 μL三聯液（10%十二烷基硫酸鈉，5%異丁醇，0.012 mol/L HCl），37℃放置過夜。于全波長Multiskan Go 1510酶標儀測定570 nm波長處吸光度值（A），應用公式計算細胞存活率，細胞存活率=A給藥/A正常×100%。

1.2.2 DTA和SH對L5178Y細胞致突變的檢測

受試藥物處理：離心收集L5178Y細胞，以DMEM培養基（含10% 馬血清）調節細胞濃度至1×106個/mL左右，轉至15 mL離心管（每管10 mL）。除非代謝活化細胞外，所有的代謝活化細胞均需加入200 μL肝微粒體S9混合液。然后將細胞分為DTA 500，250，125，62.5 μg/mL組，SH 5 000，2 500，1 250，625 μg/mL組，陽性藥組為5 μg/mL MMS（非代謝活化）和2 μg/mL CP（代謝活化），陰性對照為0.1%的DMSO。上述樣品均以2%體積分數加入細胞培養液，然后于37℃搖床震蕩處理3 h（振蕩頻率為7～18次/分）。

細胞平板效率（PE）和相對存活率檢測：處理結束后以1 000 r/min離心收集細胞，DMEM培養基重懸細胞，再次離心后吸棄培養基。以DMEM培養基（含10%馬血清）調節細胞濃度至2×105個/mL，然后吸取少量的細胞再以DMEM培養基（含20%馬血清）稀釋至8個/mL細胞懸液，置96孔板，每孔200 μL。于37℃CO2培養箱培養12 d后，計數96孔板中含有細胞集落的孔數，計算平板效率（PE0）。同時，將剩余濃度為2×105個/mL的 L5178Y細胞轉入 96孔板，每孔200 μL，于37℃ CO2培養箱表達48 h后，計算第2天的平板效率（PE2）。平板效率（PE）=-ln（EW/TW）/n，EW為不含集落孔數，TW為總孔數，n=1.6。相對存活率（RS0）=PE0test/PE0control。

細胞增長率檢測：受試藥物和細胞處理結束后，L5178Y細胞經離心、洗滌、再離心后，以DMEM培養基（含10% 馬血清）調節細胞濃度至2×105個/mL接種至24孔板中，每孔500 μL。分別在接種后的第1天和第2天進行細胞計數，并計算細胞增長率（DCG）、相對懸浮生長率（RSG）和相對總增長率（RTG）。細胞增長率（DCG）=細胞濃度次日/細胞濃度前日，相對懸浮生長率（RSG）=（DCG1d×DCG2d）test/（DCG1d×DCG2d）control，相對總增值率（RTG）=RSG×RS2。

細胞突變率檢測：受試藥物和細胞處理結束后，棄細胞上清液，以 DMEM培養基繼續培養 48 h后，將L5178Y細胞以DMEM培養基（含20%馬血清）調節細胞濃度至1×104個/mL接種至2塊96孔板（含3 μg/mL三氟胸苷），每孔200 μL（復孔），于37℃ CO2培養箱培養 10～14 d，計數含有集落的孔數，并計算突變率（MF）。突變率（MF）=-ln（EW/TW）/n/PE2，EW為不含集落孔數，TW為總孔數（192），n=2 000。

1.3 統計學處理

所有數據采用 Mutant軟件統計分析。受試藥物的突變頻率比陰性對照高2倍或以上，可判定為陽性結果。

2 結果

2.1 L5178Y細胞給藥濃度的確定

與正常組比較，DTA作用后的細胞存活率為89.65% ～94.90%，SH作用后的細胞存活率均超過100%，表明DTA和SH對L5178Y細胞無明顯細胞毒性。根據《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》［6］，結合DTA和SH藥物的溶解能力，故確定DTA的500，250，125，62.5 μg/mL和SH的5 000，2 500，1 250，625 μg/mL作為正式試驗劑量。詳見表1和表2。

表1 DTA對L5178Y細胞存活率的影響

表2 SH對L5178Y細胞存活率的影響

2.2 非代謝活化下DTA和SH對L5178Y細胞的影響DTA和 SH在無 S9活化情況下對小鼠淋巴瘤L5178Y細胞的毒性作用見表3。可見，隨著DTA和SH給藥劑量的增加，細胞的PE，RS，RSG和RTG均無明顯下降，表明DTA和SH對L5178Y細胞無顯著細胞毒性作用。與溶劑對照組比較，突變頻率（MF）隨著給藥濃度增加并無明顯上升趨勢。

2.3 代謝活化下DTA和SH對L5178Y細胞的影響由表4可知，在代謝活化試驗中，與不加S9的個劑量組類似，L5178Y細胞的PE，RS，RSG和RTG亦無明顯下降。與溶劑對照組比較，DTA和SH給藥組細胞MF亦無明顯上升趨勢。

表3 DTA和SH對L5178Y細胞TK基因的致突變性

表4 DTA和SH對L5178Y細胞TK基因的致突變性

3 討論

小鼠淋巴瘤細胞試驗（MLA）是Clive等于20世紀70年代建立的一種體外短期致突變檢測方法，可檢出包括點突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變在內的多種遺傳改變，具有很高的靈敏度［7］。MLA的檢測終點是TK基因的產物胸苷激酶，胸苷激酶在體內可催化脫氧胸苷（TdR）生成胸苷酸（TMP）的反應。正常情況下，此反應并非生命所必需的過程，但如果將胸苷類似物（如三氟胸苷、TFT）加入到細胞培養物中，則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進而摻入DNA，造成細胞致死性突變。而當TK基因發生突變（tk+/-→tk-/-）導致胸苷激酶缺陷時，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，故細胞在含有TFT的培養基中能夠生長，即表現除對TFT的抗性［8］。

曼陀羅種子含有0.2%～0.4%的生物堿，其中主要以東莨菪堿、莨菪堿和阿托品等毒性成分為主［9-10］。曼陀羅子中毒量種子為2～30粒，中毒癥狀有頭暈、嘔吐、心慌、幻視，嚴重者出現意識喪失、瞳孔散大、昏迷等，因此曼陀羅子對機體的毒性作用值得關注。在前期預試驗中，利用MTT比色法檢測15.625，31.25，62.5，125，250，500 μg/mL的 DTA及 10，100，1 000，10 000 μg/mL的SH對小鼠淋巴瘤L5178Y細胞的毒性作用，結果表明DTA和SH對L5178Y細胞存活率均無顯著降低作用。

本試驗中，500 μg/mL是DTA在DMSO中的最大溶解量，而10 g/L的SH對L5178Y細胞亦無明顯毒性作用，因此根據《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》，確定500 μg/mL的DTA和5 g/L的SH作為正式試驗最高劑量。本試驗中利用62.5，125，250，500 μg/mL的DTA和625，1 250，2 500，5 000 μg/mL的SH在非活化（不加S9）和活化（加S9）情況下對小鼠淋巴瘤L5178Y細胞進行誘導，結果顯示，隨著DTA和SH給藥劑量的增加，細胞的PE，RS，RSG和RTG均無明顯下降，提示DTA和SH對L5178Y細胞無顯著細胞毒性作用。與溶劑對照組比較，隨著給藥濃度的增加，DTA和其最主要的生物堿成分東莨菪堿處理后的L5178Y細胞突變頻率（MF）并未出現明顯上升趨勢，提示62.5～500 μg/mL的DTA和625～5 000 μg/mL的SH對小鼠淋巴瘤細胞TK基因無致突變作用。但目前遺傳毒性評價中，通常采用體外和體內遺傳毒性試驗組合的方法，以減少遺傳毒性受試物的假陰性結果。因此，曼陀羅子是否確無遺傳毒性，還需進一步通過體內骨髓細胞染色體畸變或Ames致突變等實驗進行驗證。

［1］新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所.中華本草-維吾爾藥卷［M］.上海：上海科學技術出版社，2005：340.

［2］熱比姑麗·伊斯拉木，尤力都孜·買買提，艾西木江·熱甫開提，等.新疆曼陀羅子炮制品一般毒性研究［J］.中國基層醫藥，2010，17（19）：2 595-2 597.

［3］李治建，阿不都吉力力，閆 明，等.曼陀羅子提取物小鼠急性毒性實驗研究［J］.中國民族醫藥雜志，2010（5）：41-42.

［4］李治建，凱賽爾·阿不都克熱木，阿不都吉力力·阿不都艾尼，等.曼陀羅子提取物對Beagle犬長期毒性實驗研究［J］.醫藥導報，2011，30（4）：419-422.

［5］GB 15193.20-2003，TK基因突變試驗標準 ［S］.

［6］［ZH］GPT 2-1，藥物遺傳毒性研究技術指導原則［S］.

［7］笪紅遠，曾文，江振洲，等.大黃酸對小鼠淋巴瘤L5178Y細胞TK基因的致突變作用［J］.中草藥，2008，39（12）：1 858-1 860.

［8］鄔 鳴.用小鼠淋巴瘤細胞TK基因突變實驗評價三種黃酮類化合物的誘變性和抗誘變性［D］.成都：四川大學，2005.

［9］劉勇民.維吾爾藥志（下冊）［M］.烏魯木齊：新疆科技衛生出版社，1999：760.

［10］海熱尼沙·黑提甫.探討新疆曼陀羅子急性毒性及其生物堿含量間的關系［J］.中國民族民間醫藥，2012，21（21）：2-3.

Semen Daturae Induced TK Gene Mutation in Mouse L5178Y Cells

Peng Xiaoming，Huo Shixia，Gao Li，Yan Ming
（Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine·Prescription Laboratory of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Wulumuqi，Xinjiang，China 830049）

Objective To investigate the TK gene mutation in mouse lymphoma cell induced by semen daturae.Methods L5178Y cell was treated for 3 h by 62.5，125，250，500 μg/mL of total alkaloids of semen daturae or 625，1 250，2 500，5 000 μg/mL of scopolamine hydrobromide in the activation of metabolic and non-metabolic activation conditions.The supernatant fluid was discarded，and the DMEM media was added to continue developing for 48 h.The number of mutations cell colony in each group was calculated after L5178Y cell was cultured in 96 well plate with TFT.Results Compared with the control group，the mutation rates of L5178Y had no significant increased after total alkaloids of semen daturae or scopolamine hydrobromide treated.Conclusion 62.5-500 μg/mL semen daturae and 625-5 000 μg/mL scopolamine hydrobromide have no mutation effect on TK gene in mouse lymphoma cell.

semen daturae；scopolamine hydrobromide；L5178Y；TK gene；mutation

彭曉明（1983-），男，湖南祁東人，碩士研究生，研究方向為細胞與分子藥理學，（電子信箱）pxm1983@163.com；閆明（1959-），男，山西原平人，研究員，主要從事藥物分析與新藥研發工作，本文通訊作者，（電子信箱）yanming21cn@sohu.com。

2016-06-13）

新疆維吾爾自治區中醫民族醫藥人才培養計劃項目，項目編號：Q2015-03-05。

R285．5；R282．71

A

1006－4931（2016）19－0017－04