超高效液相色譜法測定護肝布祖熱顆粒中秦皮乙素含量

黃耀廣，陳秀英

（1.新疆維吾爾自治區喀什地區食品藥品檢驗所，新疆 喀什 844000； 2.新疆維吾爾自治區喀什地區疾病預防控制中心，新疆 喀什 844000）

超高效液相色譜法測定護肝布祖熱顆粒中秦皮乙素含量

黃耀廣1，陳秀英2

（1.新疆維吾爾自治區喀什地區食品藥品檢驗所，新疆 喀什 844000； 2.新疆維吾爾自治區喀什地區疾病預防控制中心，新疆 喀什 844000）

目的 建立測定護肝布祖熱顆粒中秦皮乙素含量的超高效液相色譜（UHPLC）法。方法 色譜柱為 Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 m），流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫，流速為0.21 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為349 nm，進樣量為1 L。結果 秦皮乙素質量濃度在1.06～21.16 g/mL范圍內與峰面積線性關系良好（r=0.999 7）；加樣回收率為100.65%，RSD為0.97%（n=6）。結論該方法簡便、準確，測得結果穩定性、重復性好，可用于該制劑中秦皮乙素含量測定。

含量測定；超高效液相色譜法；秦皮乙素；菊苣；護肝布祖熱顆粒

護肝布祖熱顆粒是維吾爾醫成方制劑中保肝護肝的傳統古方，由芹菜子、菊苣子、菟絲子、芹菜根、茴香根皮、菊苣根、小茴香7味藥材組方［1］。其具有補益肝、胃，散氣止痛，利膽，利水的功效，常用于治療肝寒、胃痛、脾阻脅痛、關節骨痛及風濕病、泌尿系統疾病，療效確切，不良反應少，是一種安全有效的藥物［2］。原方收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·維吾爾藥分冊》中，原質量標準過于簡單，未收載含量測定方法，故不能很好地對該制劑進行質量控制［1］。本試驗中以具有較好保肝活性的秦皮乙素為評價指標［3-5］，建立超高效液相色譜（UHPLC）法測定護肝布祖熱顆粒中秦皮乙素的含量測定方法，以完善該制劑的質量控制標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY型超高效液相色譜儀，ACQUITY型PDA（美國Waters公司），MS205DU型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Elmasonlc E 100H型高功率超聲波清洗器（德國Elmasonlc公司）。

1.2 試藥

秦皮乙素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110741-200506）；護肝布祖熱顆粒（新疆維吾爾藥業有限責任公司，批號分別為141226，140335，1309552）；乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、磷酸為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4磷酸%（B），線性梯度洗脫，見表1；檢測波長：349 nm；進樣量：1 μL；柱溫：30℃；流速：0.21 mL/min。在上述色譜條件下，秦皮乙素的保留時間為4.089 min，理論板數按秦皮乙素峰計大于6 000，秦皮乙素峰與相鄰峰分離度大于1.5。在此條件下的色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

取秦皮乙素10.58 mg，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液，質量濃度為 52.90 μg/mL。取樣品（批號為 141226），研細，精密稱取5 g，加甲醇50 mL超聲（功率50/60 Hz）30 min，放冷后過濾，并用20 mL甲醇沖洗殘渣，合并提取液，濃縮至近干，用甲醇溶解，定容至10 mL，作為供試品溶液。按護肝布祖熱顆粒處方，不加菊苣根、菊苣子，依法制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

陰性干擾試驗：分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液適量，按擬訂色譜條件進樣，供試品溶液中，在與對照品溶液色譜相應位置有相同色譜峰，而陰性對照品溶液在相同時間處無此色譜峰，表明陰性對照品溶液對測定無干擾，見圖1。

線性關系考察：精密吸取秦皮乙素對照品貯備液（質量濃度為52.9 μg/mL）0.2，0.4，1.0，2.0，4.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按擬訂色譜條件進樣測定，以對照品溶液的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得秦皮乙素的回歸方程 Y=14 833 X-2 304，r=0.999 8（n=5）。結果表明，秦皮乙素質量濃度在1.06～21.16 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

表1 流動相線性梯度洗脫程序

圖1 超高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取同一秦皮乙素對照品溶液（質量濃度為10.58 μg/mL）1 μL，按擬訂色譜條件下重復進樣6次，測定，記錄峰面積。結果的 RSD為0.43%（n=6），表明儀器精密度良好，詳見表2。

表2 精密度試驗結果（n=6）

穩定性試驗：取同一供試品（批號為141226）溶液1 μL，分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定峰面積。結果的 RSD為1.88%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定，詳見表3。

表3 穩定性試驗結果

重復性試驗：精密稱取同一批（批號為141226）樣品6份，依法制備供試品溶液，進樣測定，并計算含量。結果秦皮乙素平均含量為10.62 μg/g，RSD為1.30%（n=6），表明該方法重復性較好，見表4。

表4 重復性試驗結果（n=6）

加樣回收試驗：精密稱取同一批（批號為141226）已知含量的供試品6份，每份4 g，分別精密加入秦皮乙素對照品貯備液（質量濃度為52.9 μg/mL）1.0 mL，依法制備供試品溶液，并按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算含量，計算回收率。結果見表5。

表5 秦皮乙素加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品（批號分別為141226，140335，1309552）依法制備供試品溶液，并按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算秦皮乙素的含量，見表6。

表6 護肝布祖熱顆粒中秦皮乙素的含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 提取條件選擇

本試驗考察了不同提取方法（回流、超聲）、提取溶劑（50%甲醇、純甲醇、50%乙醇、純乙醇）、提取時間（10，20，30，40，50 min）對提取效率的影響。結果用甲醇超聲提取30 min效果最佳，回收率完全滿足色譜分析的要求。

3.2 測定波長選擇

通過二極管陣列檢測器對秦皮乙素于210～400 nm波長范圍內進行光譜掃描，發現秦皮乙素的最大吸收波長為349 nm，故選擇349 nm為該方法的檢測波長。經試驗，其他成分、溶劑及輔料在該波長下對秦皮乙素的測定均無干擾。

3.3 流動相選擇

經多次試驗，比較了甲醇-0.4%甲酸、乙腈-0.4%甲酸、甲醇-0.4%磷酸、乙腈-0.4%磷酸等流動相對該制劑中秦皮乙素分離效果的影響，確定乙腈-0.4%磷酸梯度洗脫分離效果良好、峰形對稱且陰性樣品無干擾［6］。

［1］WS3-BW-0135-98，中華人民共和國衛生部藥品標準·維吾爾藥分冊［S］.

［2］呂 洋.肝炎檢測的臨床意義和用藥指導［J］.中國藥物經濟學，2014（1）：250-251.

［3］閆 明，黃 毅，刁娟娟，等.菊苣子的理化鑒別研究［J］.時珍國醫國藥，2006，17（12）：2 447-2 448.

［4］Wu HK，Su Z，Aisa HA，et al.Components of Cichorium glandulosumseeds［J］.Chem Nat Compd，2007，43（4）：472-473.

［5］Wu HK，Su Z，Yili A，et al.Isolation of esculetinfrom Cichorium glandulosum by high-speed counter-current chromatography［J］. Chem Nat Compd，2007，43（1）：109.

［6］胡君萍，迪利拜爾·馬木提，李 淵，等.UPLC同時測定維藥毛菊苣和菊苣中5種化學成分的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（17）：65.

Content Determination of Aesculetin in Hugan Buzure Granules by UHPLC

Huang Yaoguang1，Chen Xiuying2
（1.Kashgar Food and Drug Administration，Kashgar，Xinjiang，China 844000；2.Kashgar Center for Disease Control and Prevention，Kashgar，Xinjiang，China 844000）

Objective To establish an UHPLC method for the content determination method of aesculetin in Hugan Buzure Granules. M ethods The column was Acquity UPLC BEH C18column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；the mobile phase was acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution，gradient elution；the flow rate was 0.21 mL/min，the column temperature was 30℃，the detection wavelength was 349 nm，the sample volume was 1 μL.Results Aesculetin showed good linear relationship in 1.06-21.16 μg/mL（r=0.999 7），the average recovery rate was 100.65% and the RSD=0.97%（n=6）.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible.It can be used for the content determination of aesculetin in the preparation.

content determination；UHPLC；aesculetin；chicory；Hugan Buzure Granules

黃耀廣（1979-），男，漢族，大學本科，副主任藥師，研究方向為藥品質量控制和實驗室質量管理，（電話）0998-2822109（電子信箱）359543147@ qq.com。

2016－04－20；

2016－06－16）

R284．1；R286．0

A

1006－4931（2016）19－0056－03