胚胎干細胞來源神經干細胞調控巨噬細胞的實驗研究①

祝 文 袁亞迎 焦峰軍

(咸陽市第一人民醫院重癥醫學科,咸陽712001)

胚胎干細胞來源神經干細胞調控巨噬細胞的實驗研究①

祝 文 袁亞迎 焦峰軍

(咸陽市第一人民醫院重癥醫學科,咸陽712001)

目的：觀察胚胎干細胞(Embryonic stem cell,ESC)來源的神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)對骨髓巨噬細胞的增殖、吞噬及分泌細胞因子的影響，為探討NSCs免疫調節及在重大疾病中的應用做鋪墊。方法：培養骨髓巨噬細胞，收集胚胎干細胞來源NSCs(ESC-NSCs)的上清液處理巨噬細胞，然后利用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,SRB)法檢測增殖情況；利用紅熒光beads檢測吞噬能力；ELISA法檢各組TNF-α和IL-1β表達情況。結果：成功從ESC獲得具有NSCs特征的細胞。對照組、NSC組巨噬細胞增殖率分別為100%、(126.29±5.41)%，beads吞噬率分別為(70.23±2.57)%、(90.32±8.49)%。相比對照組，NSC組巨噬細胞TNF-α和IL-1β含量下降(P<0.05)。結論：ESC來源的NSCs具有促進骨髓巨噬細胞增殖及增強其吞噬能力，并抑制其炎性因子分泌，為NSCs免疫調節作用提供新的依據。

神經干細胞；胚胎干細胞；巨噬細胞；吞噬；細胞因子

神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)是一類具有自我復制及多潛能分化的細胞，其可從胚胎及成年腦組織、臍帶血分離，也可定向誘導胚胎干細胞(Embryonic stem cell,ESC)而獲得[1-3]。近年來，干細胞的免疫調節越來越受到重視[4]。巨噬細胞是機體重要的免疫細胞之一，在特異性免疫反應的誘發和免疫調節中起關鍵作用[5]。但目前NSCs對巨噬細胞的調控作用還不清楚。本實驗主要觀察ESC-NSCs對骨髓來源巨噬細胞增殖、吞噬能力的影響，從而為下一步探索NSCs免疫調控及炎癥調節作用、機制及其在重大疾病中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑 清潔級6～8周C57BL/6小鼠，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供；小鼠胚胎干細胞F12由美國新澤西州立大學干細胞研究中心Melitta Schachner教授贈送，于實驗室保存；紅色熒光beads(Sigma公司)，胎牛血清(Cellgro公司)，DMEM、DMEM/F12培養基、B27添加劑、N2添加劑、bFGF、EGF、Accutase(Gibco公司)，Mitomycin、Gelatin、油紅、Polybrene(Sigma公司)，LIF(Millipore公司)，TNF-α和IL-1β ELISA盒(Biolegend公司)，大鼠抗小鼠F4/80抗體、兔抗小鼠nestin抗體、兔抗小鼠β-tubulin抗體和大鼠抗小鼠GFAP抗體均購自Abcam公司，相應的山羊抗大鼠、山羊抗兔Alexa Fluor 555、488染料標記的熒光二抗購自Life technologies公司，Hoechst33342熒光染料購自Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胚胎干細胞來源的NSCs培養 首先制備小鼠胚胎成纖維細胞滋養層。將小鼠胚胎成纖維細胞滋養層接種于0.1%明膠(Gelatin)包被的培養皿，待其生長至80%～90%用絲裂霉素處理；然后將ESC接種于絲裂霉素處理過的滋養層上，每天按1 000 U/ml添加白細胞抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)，3～4 d傳代一次，逐漸轉化成無需飼養層的懸浮培養。最后，將ESC制成單細胞，在NSCs誘導培養液中培養、鑒定并收集誘導完成后的細胞上液清。

1.2.2 骨髓來源的巨噬細胞分離、培養 在無菌操作下取出小鼠完整的股骨及脛骨，在干骺端兩頭切開并用27G針頭沖出全部骨髓細胞，制成單細胞懸液、調整細胞(不包括紅細胞)濃度至2×106ml，培養7 d后，鑒定并進行下一步相關實驗。

1.2.3 實驗分組 根據處理巨噬細胞的不同培養基分為對照組(即NSCs的培養液)和NSC組(即ESC來源NSCs的上清液)。

1.2.4 增殖、吞噬實驗 按4 000 個細胞/孔接種于96孔，處理3～4 d后利用SRB比色法檢測細胞增殖情況。為了觀察 ESC-NSCs對巨噬細胞吞噬功能的影響，加入Beads 1 h后洗滌、固定、拍照并分析結果。

1.2.5 巨噬細胞上清液中TNF-α和IL-1β的檢測 先用相應的上清液處理細胞24 h，然后添加10 ng/ml干擾素γ(Interferon-γ,IFN-γ)，繼續孵育24 h后，收集上清液利用ELISA試劑盒檢測上清液TNF-α和IL-1β含量。具體步驟如下：Capture抗體稀釋液，4℃過夜，1%BSA室溫封閉1 h；洗滌4次，加入相應的標準品和樣品，每一樣本設兩個重復孔，室溫中搖晃2 h；洗滌后，加入抗體稀釋液(1∶200)，室溫孵育1 h；洗滌4次，加入100 μl Avidin-HRP稀釋液(1∶1 000)，室溫1 h；洗滌5次后，加入100 μl TMB溶液，避光孵育15～30 min；加入100 μl終止液(2N硫酸)，然后在酶標儀570 nm讀值；制作標準曲線，計算結果。

2 結果

2.1 ESC-NSCs及巨噬細胞的形態觀察及鑒定 ESC 細胞株F12在飼養層存在的條件下，貼壁生長(圖1A)。ESC定向誘導后，可形成神經球，經免疫熒光染色結果顯示整個神經球均勻表達Nestin(紅色，圖1B)。去生長因子誘導分化5 d后檢測到β-tubulin陽性(圖1C)和GFAP陽性細胞(圖1D)，可見成功獲得ESC-NSCs。

骨髓細胞經體外培養7后，細胞呈棱形、橢圓形，巨噬細胞標記物F4/80染色結果呈現大部分為陽性細胞，可用于下一步實驗，圖2。

2.2 增殖實驗 相比于對照組(100%)，ESC-NSCs組增殖率(126.29±5.41%)增高 ，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.3 巨噬細胞的吞噬功能 NSC組(90.32±8.49)%較對照組巨噬細胞吞噬率(70.23±2.57)%增高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖1 ESC-NSCs形態觀察及鑒定Fig.1 Morphological observation and identification of ESC-NSCs

圖2 巨噬細胞的形態觀察及鑒定Fig.2 Morphological observation and identification of macrophage

圖3 巨噬細胞的增殖情況Fig.3 Proliferation of macrophagesNote:*.P<0.05.

圖4 巨噬細胞吞噬實驗Fig.4 Phagocytosis assay of macrophages

圖5 巨噬細胞細胞因子TNF-α和IL-1β的含量Fig.5 Level of TNF-α and IL-1β by macrophagesNote:*.P<0.05.

2.4 巨噬細胞TNF-α和IL-1β表達情況 CON上清液處理后添加IFN-γ組較CON上清液處理后未添加IFN-γ組TNF-α和IL-1β均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組和NSC組TNF-α濃度分別為(131.18±18.57) pg/ml、(58.36±5.43) pg/ml；IL-1β濃度分別為(100.25±413.03) pg/ml、(20.41±2.20) pg/ml。相比于對照組，NSC組巨噬細胞促炎性細胞因子TNF-α和IL-1β含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

3 討論

NSCs治療中樞神經系統疾病的機理主要包括替代缺損的神經細胞，分泌多種神經營養因子起營養和促進損傷脊髓再髓鞘化等作用[6-8]。目前，干細胞的免疫調節越來越受重視，是干細胞研究領域的熱點[9]。NSCs通過T細胞和B細胞等免疫細胞發揮免疫調控作用已經得到廣泛認可[10-12]。巨噬細胞是機體重要的免疫細胞之一，在特異性免疫反應的誘發和免疫調節中起關鍵作用。目前，NSCs對巨噬細胞的調控作用及機制還未明確。在本研究中，我們發現胚胎干細胞來源的NSCs可促進骨髓巨噬細胞增殖和提高其吞噬能力，同時降低對促炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌。

NSCs在免疫調控和炎癥反應中的作用逐漸受到重視。Jia等[13]報道小鼠和大鼠的神經干/前體細胞能促進小膠質細胞(中樞神經系統的巨噬細胞)激活、增殖。巨噬細胞在不同微環境及不同的因子作用下可極化成不同的表型，根據極化后細胞表面標示性分子及功能的不同，巨噬細胞大體可分為兩種類型，即M1和M2型[14]。LPS等因子作用下巨噬細胞可極化為M1型，高表達TNF-α、IL-6等促炎因子；而IL-4等可促進巨噬細胞通常向M2型極化。M2巨噬細胞特征為低表達TNF-α、IL-6、高表達IL-10，具有抑制Th1免疫反應，促進損傷組織修復、重構和血管生長功能[15，16]。我們實驗發現，與對照組相比神經干細胞上清液處理組的巨噬細胞低表達促炎性因子TNF-α和IL-1β。結合Jaehyup等[17]研究結果，我們推測NSCs調控的巨噬細胞可能是M2型巨噬細胞，下一步將檢測M1/M2特異標志物。

同時，干細胞調控巨噬細胞主要是通過細胞之間直接接觸和分泌可溶性因子起作用。本實驗證實NSCs上清液具有調控巨噬細胞的作用，說明胚胎干細胞來源的NSCs可能主要通過分泌某種或某些可溶性因子(或微小結構)發揮免疫調節作用。有研究表明血管內皮生長因子(Vascular endothelia growth factor,VEGF)可促進小膠質細胞增殖、遷移和增強其吞噬能力[18]。利用免疫親和磁珠或shRNA技術從神經前體細胞上清液去除VEGF，神經前體細胞對小膠質細胞作用消失[19]。轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)，基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(Tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1)等因子在NSCs免疫調節中也具有重要作用[20]。但是NSCs調控骨髓來源巨噬細胞的因子還需要進一步證實。同時，外泌體(Exosome)直徑30～150 nm，攜帶一些重要信號分子，具有廣泛的生物學活性。外泌體是干細胞發揮生物學作用過程中的關鍵因素。我們已經初步從NSCs上清液中分離獲得外泌體并發現其具有與上清液類似的抗炎作用(數據待發表)。因此，NSCs也可能通過外泌體而實現免疫調節作用。有研究表明NSCs移植具有一定的致瘤性[21,22]。我們的研究給NSCs治療提供一種新的方式，即采用細胞上清液進行疾病的治療，這樣將有效避免干細胞移植后發生腫瘤的可能。然而，體內條件下，機體的免疫調節功能是極其復雜的。我們相信，隨著對NSCs免疫調節作用研究的深入，必將為其臨床應用提供更堅實的實驗基礎。

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[收稿2016-04-06 修回2016-05-11]

(編輯 張曉舟)

Effect of embryonic stem cells-derived neural stem cells on macrophage in vitro

ZHU Wen,YUAN Ya-Ying,JIAO Feng-Jun.

Department of Critical Care Medicine,the First People′s Hospital of Xianyang City,Xianyang 712001,China

Objective:To explore the influence of embryonic stem cells-derived neural stem cells on the proliferation and secretion cytokines of bone marrow-derived macrophages.Methods:Mouse bone marrow derived macrophages were isolated and cultured in L929 medium.After macrophages were treated with NSCs supernatant for 3 days,SRB method was used to detect the proliferation of macrophages.The phagocytosis of macrophages were detected by incubating with RFP-Beads for 1 h.Meanwhile,the expression of TNF-α and IL-1β were detected by ELISA.Results:NSCs were successfully induced from ESC.In control group and NSC group,the proliferation rate of macrophages were 100 % and (126.29 ± 5.41)%,the phagocytosis rate were (70.23 ± 2.57)% and (90.32 ± 8.49)%.Compared to the control group,the levels of IL-6,IL-1β in macrophage treated with NSCs decreased (P<0.05).Conclusion:ESC-derived NSCs can promote the proliferation and phagocytosis of bone marrow-derived macrophage,and suppress the secretion of pro-inflammatory cytokines.

Neural stem cells;Embryonic stem cells;Macrophage;Phagocytosis;Cytokines

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.003

①本文為國家自然科學基金(81571209)資助項目。

祝 文(1984年-)，女，碩士，主治醫師，主要從事中樞神經系統疾病及免疫的研究，E-mail：396242390@qq.com。

及指導教師：焦峰軍(1969年-)，男，副主任醫師，主要從事脊髓損基礎及臨床研究，E-mail：Jiaofengjun@aliyun.com。

R392.4

A

1000-484X(2016)12-1741-04