γ-促分泌酶抑制劑對毛細支氣管炎模型大鼠體內Th17細胞分化的影響①

王海英 劉良宵 吳福玲 高 萌

(濱州醫(yī)學院，煙臺264003)

γ-促分泌酶抑制劑對毛細支氣管炎模型大鼠體內Th17細胞分化的影響①

王海英 劉良宵 吳福玲 高 萌

(濱州醫(yī)學院，煙臺264003)

目的：研究γ-促分泌酶抑制劑阻斷Notch信號對毛細支氣管炎(簡稱毛支)模型大鼠Th17細胞發(fā)育和分化的影響，為毛支治療尋找新的藥物提供理論基礎。方法：按隨機對照原則將SD大鼠分為正常組、毛支組和γ-促分泌酶抑制劑組，滴鼻法成功建立毛支模型，而后尾靜脈注射γ-促分泌酶抑制劑MW167，通過HE染色觀察肺組織病理改變，ELISA檢測血漿中白介素17(IL-17)的水平，實時熒光定量PCR檢測肺組織和外周血單個核細胞中RORγt mRNA的表達，Western blot檢測肺組織中Notch信號、RORγt的蛋白表達。結果：與毛支組相比，MW167組肺組織病理學改變減輕；血漿IL-17水平也較毛支組降低；肺組織及外周血單個核細胞RORγt mRNA在MW167注射組表達均減弱；MW167組肺組織Notch信號和RORγt蛋白的表達也顯著降低。結論：靜脈注射γ-促分泌酶抑制劑能夠通過阻斷Notch信號通路抑制Th17細胞的分化，緩解毛支模型大鼠的氣道炎癥，對毛支有潛在的治療價值。

毛細支氣管炎；Notch；γ-促分泌酶抑制劑；Th17細胞

毛細支氣管炎是一種常見于嬰幼兒的下呼吸道感染性疾病，多發(fā)于冬季，其最主要病原體為呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)，病毒侵入人體后會誘發(fā)T細胞性免疫應答，大量實驗證明在毛支炎癥過程中除了Th1/Th2細胞應答失衡外，Th17細胞反應在其發(fā)病過程中也占有重要地位[1,2]。Notch信號通路是普遍存在于從無脊椎動物到哺乳動物的高度保守的信號序列，能夠調節(jié)T細胞的分化及發(fā)育[3]。有研究證明Notch信號通路阻斷劑不僅可以調節(jié)Th1和Th2免疫應答減輕肺部炎癥反應，還可能通過調節(jié)Th17反應影響炎癥過程[4]。本實驗通過向毛支模型大鼠體內注射γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor,GSI)阻斷Notch信號，研究Notch信號對Th17細胞分化及發(fā)育的影響，探討改善毛支癥狀的新方法，為毛支治療尋找新的藥物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠24只，7周齡，購自青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社；RSV病毒，由山東省病毒研究所饋贈；γ-促分泌酶抑制劑Ⅱ(MW167)為德國默克密理博公司產品；白細胞介素17(Interleukin,IL-17)ELISA試劑盒購自朗頓公司；TRIzol、cDNA試劑盒及SYBR Green熒光試劑盒為TaKaRa公司產品，引物購自上海生工公司；兔抗大鼠RORγt多克隆抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 制備RSV懸液 將RSV病毒滴入長滿單層Hela細胞的培養(yǎng)瓶，吸附1 h，然后加入含2%胎牛血清的細胞維持液，放入培養(yǎng)箱。顯微鏡下觀察細胞的病變情況，待病變達100%時收獲病毒，用力震蕩培養(yǎng)瓶，使細胞從瓶壁脫落，而后反復凍融3次，離心，收集含RSV的上清液。計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infective dose,TICD50)，并稀釋至5×104TICD50/0.1 ml。

1.2.2 動物分組和模型制備 將24只大鼠隨機分為3組，分別為正常對照組、毛支組、γ-分泌酶抑制劑組，每組8只。毛支動物模型制備，將病毒按照0.4 μl/g滴入毛支組和γ-分泌酶抑制劑組大鼠兩側鼻孔，正常組以相同的量滴入細胞培養(yǎng)液。毛支模型制備完成后，將MW167按1 mg/kg的體質量尾靜脈注射到γ-分泌酶抑制劑組大鼠體內，間隔48 h至1周，即分別于第1、3、5、7天注射，剩余兩組用PBS代替MW167進行尾靜脈注射。

1.2.3 外周血單個核細胞(Peripheral blood mono-nuclear cell,PBMC)的收集 于末次藥物注射2 d后，麻醉大鼠，暴露腹腔，輕輕分離出腹主動脈，抗凝取血。將收集的血液按照大鼠外周血淋巴細胞分離液試劑盒所提供方法提取PBMC。

1.2.4 肺組織病理觀察 暴露大鼠胸腔，用PBS灌洗肺組織，然后將一葉肺置于40 g/L多聚甲醛中固定，制成石蠟切片，行HE染色，觀察肺組織病理學變化。

1.2.5 實時定量PCR檢測肺組織中RORγt mRNA的水平 用Trizol法提取肺組織中總RNA。按照TaKaRa反轉錄試劑盒方法進行逆轉錄。采用SYB Green實時熒光定量PCR檢測基因表達，大鼠的GAPDH作為內參基因，大鼠RORγt上游引物為5′-CCTCCTGCCACCTTGAGTAT-3′，下游引物為5′-TCTGAGCCCTGTTCT-3′，產物長度130 bp，按照TaKaRa的SYBR Green 熒光PCR試劑盒說明進行擴增，反應體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq聚合酶10 μl、上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、cDNA 2 μl、50×ROX Reference Dye 0.4 μl、無核酸酶水6.8 μl。反應條件：95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 20 s,50個循環(huán)。反應結束設定最佳閾值線，設正常對照組基因表達為1，獲得其他各組基因表達的相對值。

1.2.6 ELISA檢測血漿中IL-17的水平 大鼠腹主動脈取血，抗凝處理后離心，取上血漿層，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿中IL-17的水平。

1.2.7 Western blot法檢測肺組織中RORγt的表達 將肺組織用蛋白裂解液裂解，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，上樣量為60 μg。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉移到PVDF膜上；然后脫脂奶粉封閉2 h；兔抗大鼠RORγt多克隆抗體(1∶500)，4℃封閉過夜；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育1 h；DAB法顯色。用電泳凝膠成像分析儀采集結果。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多組間比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠癥狀、體征觀察 毛支組大鼠在接種病毒后出現(xiàn)輕微卡他性鼻炎，口唇發(fā)紺，活動度減弱等表現(xiàn)。MW167組大鼠的上述表現(xiàn)減輕。正常對照組大鼠無異常表現(xiàn)。

2.2 肺組織形態(tài)學分析 比較3組大鼠肺組織HE病理切片。與正常組相比，毛支組大鼠肺組織炎癥明顯，炎細胞在支氣管及血管周圍廣泛浸潤，支氣管黏膜增厚，管腔狹窄，說明毛支模型制備成功。與毛支組相比，MW167組的炎癥表現(xiàn)顯著減輕，炎細胞浸潤程度顯著減少，黏膜增厚不明顯，肺泡腔內偶有炎細胞，說明MW167有緩解毛支病理變化的作用。見圖1。

2.3 大鼠肺組織和PBMC中RORγt mRNA的表達 與正常組相比，毛支組和 MW167 組大鼠的肺組織和PBMC中RORγt mRNA表達均增高，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01；MW167組較毛支組表達降低，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01。見圖2。

圖1 肺組織病理改變(HE，×400)Fig.1 Observation of lung tissue(HE，×400)Note:A.Normal group;B.Bronchiolitis group;C.γ-secretase inhibitor group.

圖2 各組大鼠肺組織及外周血中RORγt mRNA的表達Fig.2 Expression of RORγt mRNA in lung tissue and PBMCNote:Compared with RSV group,**.P<0.01.

圖3 各組大鼠血漿IL-17的水平Fig.3 Expression of IL-17 in plasmaNote:Compared with RSV group;**.P<0.01.

圖4 Western blot檢測各組大鼠肺組織相關蛋白表達Fig.4 Western blot detect associated protein expression in lung tissueNote:1.Normal group;2.Bronchiolitis group;3.MW167 group;compared with RSV group,**.P<0.01.

2.4 大鼠血漿IL-17的水平 毛支組大鼠血漿IL-17水平顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01；MW167組IL-17較毛支組表達降低，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01。見圖3。

2.5 大鼠肺組織中蛋白表達水平 毛支組大鼠肺組織中NICD和RORγt蛋白表達較正常組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；MW167組這兩種蛋白表達較毛支組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

3 討論

毛細支氣管炎是造成嬰幼兒住院的最常見原因，與哮喘的發(fā)生密切相關，嚴重影響著嬰幼兒的身體健康[5]。毛支患兒的主要病理特點除了Th1和Th2失衡外，Th17細胞的功能狀態(tài)也發(fā)生了相應變化。

Th17細胞被認為是區(qū)別于Th1和Th2細胞的第三類來自效應CD4+T細胞的細胞群，可特異性表達轉錄因子視黃酸受體相關孤核受體γt(Retinoid-related orphan nuclear receptor，RORγt)[6]。Th17細胞是一種重要的促炎細胞，過強的Th17應答會造成炎癥和其他病理改變[7]。IL-17是Th17細胞分泌的最重要的炎癥因子，IL-17有招募和活化中性粒細胞及淋巴細胞到氣道的功能，刺激它們及其他類型細胞分泌炎癥介質，IL-17還能夠阻斷CD8+淋巴細胞清除病毒顆粒的能力，協(xié)同體內的固有免疫系統(tǒng)加劇炎癥反應[8-10]。有研究發(fā)現(xiàn)在分化成熟的Th17細胞內RORγt的表達呈現(xiàn)特異性的增高[11]。我們的前期研究也表明在毛支大鼠中Th17細胞分泌的細胞因子IL-17、IL-23及其轉錄因子RORγt濃度較正常組大鼠顯著增高，這些細胞因子會造成炎細胞浸潤，導致黏液分泌并降低肺功能[12]。

在哺乳動物中，有4種Notch受體和5種Notch配體。一個完整的Notch信號通路包括其受體、配體及細胞內效應分子(CSL-DNA結合蛋白)三部分組成。Notch信號起始于其相鄰受體和配體的結合，然后通過一系列的酶促反應引起Notch受體胞內段(Notch receptor intracellular domain，NICD)的釋放并轉移到細胞核內，誘導下游基因轉錄激活[13]。Amsen[14]研究證明Notch信號通路在T細胞的增殖、分化及細胞功能調節(jié)方面都具有重要作用。

研究證明Notch信號能夠調節(jié)Th17細胞的分化，阻斷Notch信號將抑制Th17細胞應答[3,15]。Notch信號通路還能夠直接促進Th17相關的細胞因子及其轉錄因子的表達。細胞實驗顯示，與對照組相比，經GSI處理過的Th17細胞分泌的IL-17及RORγt的表達均明顯降低。體內試驗中，Keerthivasan等[16]用GSI阻斷多發(fā)性腦脊髓炎模型小鼠Notch信號通路后，Th17細胞分泌的細胞因子IL-17及其轉錄因子RORγt亦顯著降低。本實驗中，毛支大鼠注射GSI后，IL-17和RORγt表達減少，與上述結論相一致。另有研究證明用GSI阻斷哮喘大鼠模型的Notch信號通路后，肺組織NICD表達降低，血漿IL-17分泌減少，氣道炎癥緩解，臨床癥狀改善，說明GSI能夠抑制Th17細胞分化，減少IL-17的產生，緩解哮喘大鼠的氣道炎癥，是治療哮喘的有效措施[4]。本實驗中，阻斷毛支模型大鼠Notch信號通路后，肺組織NICD、RORγt表達降低，另外肺組織及PBMC中RORγt mRNA表達亦降低，IL-17分泌減少，同時HE染色也可觀察到氣道炎癥的緩解，以上結果均說明阻斷Notch信號通路能夠緩解毛支大鼠癥狀。

綜上所述，Notch信號通路能夠通過調節(jié)Th17細胞的功能和狀態(tài)影響毛支病情及預后。本實驗通過注射GSI阻斷毛支大鼠Notch信號通路，抑制了Th17細胞應答，減弱了其促炎作用，緩解了毛支炎癥，為毛支的治療提供了新的思路。

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[收稿2016-05-16 修回2016-06-12]

(編輯 倪 鵬)

Affection to differentiation of Th17 cell in bronchiolitis rat models after injecting γ-secretase inhibitor

WANG Hai-Ying,LIU Liang-Xiao,WU Fu-Ling,GAO Meng.

Binzhou Medical University,Yantai 264003,China

Objective:To investigate the affection to the differentiation of Th17 cell in rat models of bronchiolitis after blocking Notch signaling by γ-secretase inhibitor and provide rationale to seek new target for bronchiolitis drug treatment.Methods:The rats were randomly divided into normal group,bronchiolitis group and γ-secretase inhibitor group.The model of bronchiolitis was established successfully by nasal dripping,and γ-secretase inhibitor(MW167) was injected into the vena caudalis.The pathological changes of the airway were observed by HE staining;the plasma level of interleukin17(IL-17) was detected by ELISA;the level of RORγt mRNA in lung tissues and peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) was tested by real-time quantitative PCR;the levels of Notch signaling and RORγt protein in lung tissues were examined by Western blot.Results:Compared to the bronchiolitis group,the histopathologic change in MW167 intravenous injection group was significantly alleviated;the plasma level of IL-17 was decreased;the level of RORγt mRNA in lung tissues and PBMCs was lower in MW167-treated group than bronchiolitis group;the levels of Notch signaling and RORγt were decreased.Conclusion:γ-secretase inhibitor through intravenous injection suppresses the differentiation of Th17 cell and relieves the airway inflammation of bronchiolitis in rat models after blocking Notch signaling and has potential therapeutic value for treating bronchiolitis.

Bronchiolitis;Notch;γ-secretase inhibitor;Th17 cell

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.008

①本文受山東省自然科學基金(ZR2014HL001)和山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2013WS0312)資助。

王海英(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事毛細支氣管炎與Notch信號通路方面的研究， E-mail：13276382516@163.com。

及指導教師：吳福玲(1966年-)，女，碩士，主任醫(yī)師，教授，主要從事小兒呼吸與免疫方面的研究，E-mail：wufuling000@163.com。

R392-33

A

1000-484X(2016)12-1765-04