抗人蔗糖酶卵黃抗體的制備及其穩(wěn)定性和體外活性研究①

邵 敏 王新穎 盧毓璁 王 敏 馮 昆 魏妮娜 杜鳳霞 周鶴峰

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，珠海519041)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

抗人蔗糖酶卵黃抗體的制備及其穩(wěn)定性和體外活性研究①

邵 敏 王新穎 盧毓璁 王 敏 馮 昆 魏妮娜 杜鳳霞②周鶴峰

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，珠海519041)

目的：制備抗人蔗糖酶(Sucrase，SUC)卵黃抗體(egg yolk immunoglobulin Y,IgY)并對其穩(wěn)定性、體外活性進行研究。方法：采用人SUC蛋白為抗原，免疫海蘭灰蛋雞，水稀釋和鹽析法提取純化IgY；間接ELISA法監(jiān)測抗體效價變化并評價其穩(wěn)定性；SDS-PAGE和Western blot分析IgY的純度和特異性；PNPG法測IgY對α-葡萄糖苷酶的體外抑制效果。結(jié)果：初次免疫10 d后檢測到IgY，40 d后效價最高達到1∶12 800；提取的IgY重鏈和輕鏈分別在65 kD和25 kD處，且能夠與抗原蛋白特異性結(jié)合；29～69℃范圍內(nèi)水浴15 min和pH 4～7之間37℃水浴4 h，抗體效價無變化；胰蛋白酶與胃蛋白酶作用IgY 2 h，抗體效價降至一半，延長作用時間，IgY對胃蛋白酶耐受力較胰蛋白酶耐受力更強；IgY對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，半抑制濃度(IC50)值為0.540 mg/ml。結(jié)論：抗人蔗糖酶卵黃抗體(S-IgY)的成功制備為后續(xù)用于2型糖尿病大鼠模型體內(nèi)實驗研究奠定基礎(chǔ)。

蔗糖酶；雞；卵黃抗體；穩(wěn)定性

糖尿病是以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。α-葡萄糖苷酶抑制劑是目前臨床治療2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)口服降糖的主要藥物之一，該藥物能夠競爭性抑制小腸絨毛中α-葡萄糖苷酶的活性，延緩多糖和雙糖的分解，延遲小腸上段葡萄糖的吸收，達到降低餐后血糖的目的。目前已經(jīng)上市并在臨床上廣泛使用的為阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，這3種藥物都是在微生物及其代謝產(chǎn)物基礎(chǔ)上通過化學(xué)修飾改造獲得，一方面工藝復(fù)雜，另一方面在臨床應(yīng)用中存在一定副作用[1,2]。國內(nèi)外科研人員正不斷從動植物、海洋生物等原材料中探索具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分，但天然來源α-葡萄糖苷酶抑制劑其材料有限，同時抑制效果尚需進一步評價[3-5]。因此，探索新型來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有潛在的應(yīng)用價值。

IgY是將免疫原免疫禽類后，通過其免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的能蓄積在卵細胞中的特異性抗體，該抗體產(chǎn)量高，獲得容易，價格低廉、具有相對穩(wěn)定的耐熱、耐酸等化學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)在疾病診斷和防治等方面有廣泛的研究和應(yīng)用[6,7]。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)位于小腸膜上皮細胞刷狀緣側(cè)，由麥芽糖酶、葡萄糖化酶、SUC和異麥芽糖酶4種組成[8]。本課題組在前期研究中已經(jīng)通過基因工程手段獲得人SUC蛋白[9]，以其作為抗原，免疫產(chǎn)蛋雞，獲得特異性抗人S-IgY，通過對獲得的抗體進行穩(wěn)定性評價和體外活性等方面的研究，為今后以口服抗體藥物作為治療T2DM的新型降糖藥物類型的研究和開發(fā)奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人SUC蛋白(本課題組前期實驗獲得)；弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、α-葡萄糖苷酶(Sigma 美國)；聚丙烯酰胺、蛋白質(zhì)Marker(TaKaRa 日本)；Western blot 檢測試劑(碧云天公司)；阿卡波糖(拜耳公司 德國)。

1.1.2 儀器 冷凍高速離心機(德國 Eppendorf公司生產(chǎn))；蛋白質(zhì)電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))；Elx-800全自動酶標儀(美國Bio-Tek公司生產(chǎn))。

1.1.3 實驗動物 海蘭灰品種產(chǎn)蛋雞12只，25周齡，體重1.8～2.0 kg，珠海市金灣區(qū)養(yǎng)殖基地提供，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)動物房，雞飼料也由養(yǎng)殖基地提供。

1.2 方法

1.2.1 蛋雞免疫 將蛋雞隨機分為正常對照組和免疫SUC組。將前期實驗得到的人SUC蛋白用PBS稀釋成0.25 mg/ml，以1.0 ml/只的用量于蛋雞頸部、翼下和胸肌皮下多點免疫，首次免疫使用弗氏完全佐劑，免疫時間間隔均為2周，后續(xù)3次免疫使用弗氏不完全佐劑，對照組用PBS與佐劑乳化后免疫注射。首免后7 d開始，每天收集雞蛋并標記，4℃保存?zhèn)溆茫g接ELISA法監(jiān)測IgY效價。

1.2.2 IgY的提取純化 采用水稀釋和鹽析法提取純化IgY。75%乙醇擦拭與消毒雞蛋表面，無菌條件下分離蛋黃與蛋清，注射器吸取蛋黃并加入8倍體積的雙蒸水，調(diào)節(jié)pH為5.2，4℃靜置8 h。10 000 r/min離心25 min，上清加無水硫酸鈉至終濃度為19%(W/V)靜置2 h后10 000 r/min離心25 min，PBS溶解沉淀，加無水硫酸鈉至終濃度為14%(W/V)，靜置2 h，10 000 r/min離心25 min， 取沉淀用PBS溶解，以截留分子量為14 kD透析袋4℃透析過夜，制備的IgY -20℃保存。

1.2.3 IgY的SDS-PAGE與Western blot分析 將提取純化的IgY進行SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，考馬斯亮藍R-250染色后觀察并拍照。將人SUC重組蛋白行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜，用提取純化后的抗人S-IgY為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG為二抗，進行Western blot分析，以對照組提取的IgY作為陰性對照 。

1.2.4 間接ELISA法監(jiān)測IgY效價 用間接ELISA法對提取的抗人S-IgY進行動態(tài)監(jiān)測，按參考文獻進行[10]。以10 μg/ml重組蛋白人SUC包被酶標板，4℃過夜后， 5%脫脂奶粉PBST 37℃封閉2 h，PBST洗板5次，以1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同倍比稀釋的抗人S-IgY，每孔100 μl，37℃孵育2 h，洗板后加入酶標二抗，37℃ 2 h，加TMB顯色，終止液終止反應(yīng)，在450nm處測A值。設(shè)置陰性對照(對照組雞蛋提取的IgY)與PBS空白對照。待測IgY的A450nm值與陰性對照組IgY A450nm值之比大于2.1為陽性結(jié)果。

1.2.5 IgY的熱穩(wěn)定性試驗 抗人S-IgY用0.05 mol/L Tris-Cl緩沖液稀釋成1 mg/ml，置于29℃、39℃、49℃、59℃、69℃、79℃、89℃、99℃不同溫度的水浴中15 min，結(jié)束后立即放入冰水中冷卻，并以1∶50、1∶200、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同稀釋倍數(shù)下，每一條件設(shè)置6個復(fù)孔，用間接ELISA法檢測抗體效價，以對照組雞蛋提取的IgY為陰性對照。

1.2.6 IgY的酸堿穩(wěn)定性試驗 抗人S-IgY用pH值1～9的0.05 mol/L Tris-Cl緩沖液稀釋成1 mg/ml，37℃水浴4 h，立即用2 mol/L Tris溶液中和，調(diào)pH為7.0，并以1∶50、1∶200、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同稀釋倍數(shù)下，每一條件設(shè)置6個復(fù)孔，用間接ELISA法檢測抗體效價，以對照組雞蛋提取的IgY為陰性對照。

1.2.7 IgY的胃蛋白酶消化試驗 抗人S-IgY用pH為4.0，0.05 mol/L Tris-Cl緩沖液稀釋成1 mg/ml，以10∶1的比例在IgY中加入濃度為1 200 U/ml胃蛋白酶溶液，37℃保溫，在2、4、6、8 h不同時間點取樣檢測，用2 mol/L Tris溶液中和pH為7.0，并以1∶50、1∶200、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同稀釋倍數(shù)下，每一條件設(shè)置6個復(fù)孔，用間接ELISA法檢測抗體效價，以對照組雞蛋提取的IgY為陰性對照。

1.2.8 IgY的胰蛋白酶消化試驗 抗人S-IgY用pH為8.0，0.05 mol/L Tris-Cl緩沖液稀釋成1 mg/ml，以10∶1的比例在IgY中加入濃度為50 mg/ml的胰蛋白酶，37℃保溫，在2、4、6、8 h不同時間點取樣檢測，用2 mol/L Tris溶液中和pH為7.0，并以1∶50、1∶200、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同稀釋倍數(shù)下，每一條件設(shè)置6個復(fù)孔，用間接ELISA法檢測抗體效價，以對照組雞蛋提取的IgY為陰性對照。

1.2.9 IgY對α-葡萄糖苷酶體外抑制試驗 10 U/ml α-葡萄糖苷酶20 μl與不同濃度梯度的各200 μl抗人S-IgY和陽性對照阿卡波糖充分混合，以同體積緩沖液作為空白對照，待測樣品與陽性對照樣品濃度梯度分別為0.01、0.1、0.25、0.5、1 mg/ml，每一條件設(shè)置6個復(fù)孔，37℃水浴保溫5 min，加入1 mmol/L底物PNPG 200 μl充分混勻，37℃水浴反應(yīng)20 min，加入1 mol/L的碳酸鈉溶液500 μl終止反應(yīng)，在波長405nm下讀取吸光度值。按以下公式分別計算抗人S-IgY和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率(%)：抑制率(%)=[A空白-(A樣品-A)]/ A空白×100%，公式中A為只加樣品測定的吸光度值，作為本底。以半抑制濃度值(IC50)評價樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制程度。

2 結(jié)果

2.1 IgY的SDS-PAGE與Western blot分析 將提取純化的抗人S-IgY進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示有兩條明顯蛋白條帶，與蛋白質(zhì)Marker對比， 表明IgY重鏈在65 kD處，輕鏈在25 kD處，如圖1。將蛋白轉(zhuǎn)膜后進行Western blot分析，圖2所示，獲得的抗人S-IgY能夠與抗原蛋白特異性結(jié)合，陰性對照未出現(xiàn)結(jié)合反應(yīng)，表明已經(jīng)成功制備了抗人S-IgY。

2.2 IgY的效價監(jiān)測 采用間接ELISA法監(jiān)測抗人S-IgY效價變化情況，結(jié)果如圖3，以SUC蛋白為免疫原免疫蛋雞，在首免后第10天檢測到抗人S-IgY，隨著后續(xù)加強免疫，抗體效價逐漸增加，到40 d效價達到最高峰為1∶12 800，即在三免和四免后一段時間出現(xiàn)抗體效價最高，抗體維持20 d平臺期后效價逐漸下降，3個月后基本降至1∶2 000 以下。

圖1 抗人S-IgY的電泳圖Fig.1 SDA-PAGE analysis of S-IgYNote:M.Marker;1.S-IgY.

圖2 Western blot檢測抗人S-IgY的特異性Fig.2 S-IgY specificity detected by Western blotNote:M.Marker;1.S-IgY;2.Non-immunized IgY.

圖3 抗人S-IgY效價消長規(guī)律Fig.3 Titer variation of S-IgY after primary immunization

表1 抗人S-IgY的熱穩(wěn)定性

Tab.1 Thermal stability of S-IgY

Temperature(℃)IgYtiter291∶6400391∶6400491∶6400591∶6400691∶6400791∶1600891∶5099-

表2 抗S-IgY的酸堿穩(wěn)定性

Tab.2 Acid-base stability of S-IgY

pHIgYtiter1-2-31∶320041∶640051∶640061∶640071∶640081∶320091∶1600

2.3 熱穩(wěn)定性檢測 抗人S-IgY在29～69℃范圍內(nèi)水浴15 min抗體效價無任何變化，當溫度大于79℃以上，抗體效價大幅降低直至無活性，結(jié)果如表1。

2.4 酸堿穩(wěn)定性檢測 表2所示，抗人S-IgY在pH 4～7之間37℃水浴4 h抗體效價無任何變化，當pH≤3時，抗體效價大幅降低直至無活性，pH≥8時，抗體效價大幅下降。

2.5 胃蛋白酶和胰蛋白酶對IgY的影響 抗人S-IgY在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下都有一定程度的影響，在酶作用2 h后，抗體效價降至一半，再次增加作用時間，抗體效價進一步降低，8 h檢測不到活性。胰蛋白酶與胃蛋白酶相比，抗體效價降低更為明顯，說明IgY對胰蛋白酶耐受力更差，結(jié)果如表3所示。

2.6 阿卡波糖和IgY對α-葡萄糖苷酶體外抑制性影響 不同濃度的抗人S-IgY和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制結(jié)果如表4所示，隨著濃度不斷增加，陽性對照阿卡波糖和抗人S-IgY對α-葡萄糖苷酶抑制活性逐漸增加，呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。抗人S-IgY對α-葡葡萄糖苷酶有一定的抑制性，其IC50值為0.540 mg/ml，但與阿卡波糖(IC50=0.160 mg/ml)的抑制作用相比較弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 胃蛋白酶和胰蛋白酶對S-IgY活性的影響

Tab.3 Resistance of S-IgY against pepsin and trypsin

Time(h)IgYtiterPepsinTrypsin01∶64001∶6∶40021∶32001∶320041∶16001∶80061∶8001∶2008--

表4 抗人S-IgY和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率

Tab.4 Inhibition ratio of acarbose and S-IgY on activity of α-glucosidase

GroupsInhibitoryconce?ntration(mg/ml)Inhibitionrate(%)Blankcontrol--Acarbose001136±130S?IgY00126±0301)Acarbose010367±060S?IgY010194±0491)Acarbose025492±370S?IgY025315±1901)Acarbose050730±260S?IgY050473±2101)Acarbose100905±140S?IgY100649±5801)

Note：Compared with acarbose group，1)P<0.05 under the equal inhibition concentration.

3 討論

T2DM治療過程中，在配合飲食治療基礎(chǔ)上使用α-葡萄糖苷酶抑制劑抑制α-葡萄糖苷酶的活性達到降低餐后血糖升高的目的。本實驗選擇其中SUC作為靶點，體外通過免疫手段獲得相應(yīng)IgY，通過抗原抗體的中和反應(yīng)，以期通過口服抗體控制餐后高血糖，該研究目前在國內(nèi)外未見報道。

IgY在免疫制備過程中，免疫的途徑，注射部位，抗原用量，間隔時間，免疫次數(shù)等都是影響免疫效果的因素，本研究通過人SUC蛋白作為抗原進行4次免疫，采用弗氏佐劑和弗氏不完全佐劑，通過間接ELISA檢測抗體效價變化，在首免10 d檢測到抗體，40 d達到最高效價1∶12 800，且持續(xù)20 d。蛋雞在注射抗原后，生長狀態(tài)和產(chǎn)蛋率未受到任何影響，抗體效價水平已能夠滿足后續(xù)實驗需要，與相關(guān)研究對比發(fā)現(xiàn)，雖然高嶺等[11]曾報道高效價卵黃抗體持續(xù)5周以上，時間較長，但本實驗可以通過提高海蘭灰蛋雞的產(chǎn)蛋率，另外也可以增加蛋雞免疫數(shù)量這兩方面使獲得的抗體量增加。

若將IgY作為口服制劑用于降低血糖，需進行其對酸堿和溫度的耐受力、口服后在胃蛋白酶和胰蛋白酶水解作用下的穩(wěn)定性等方面研究。實驗發(fā)現(xiàn)，IgY可以耐受巴氏殺菌處理，且效價不變；pH 4～7范圍內(nèi)抗體活性穩(wěn)定，pH≤3時，抗體效價大幅降低直至無活性，與文獻報道基本一致[12,13]，當pH≥8時，抗體效價也大幅度下降。在酸堿穩(wěn)定性實驗的基礎(chǔ)上，在進行酶水解作用時，考慮到胃液和腸液不同的酸堿環(huán)境，選定pH為4的 Tris-Cl緩沖液稀釋抗人S-IgY 和pH為8的Tris-Cl緩沖液稀釋抗人S-IgY，分別進行胃蛋白酶與胰蛋白酶的作用，在2 h后均出現(xiàn)抗體效價大幅度下降情況，綜合以上研究結(jié)果，在后續(xù)實驗中需要探討添加合適的保護劑或?qū)gY制成不同劑型，使IgY能夠耐受酸性環(huán)境，使其在酶的作用下維持效價穩(wěn)定，同時在此保護劑和不同劑型的條件下，研究其在不同溫度不同存放時間的條件下抗體效價變化等情況，以此才能作為今后口服降糖藥物的研究基礎(chǔ)。

IgY用于動物體內(nèi)實驗前，需要體外對其活性進行探討。實驗中對比陽性對照阿卡波糖和抗人S-IgY對α-葡萄糖苷酶抑制活性，表明抗人S-IgY對α-葡葡萄糖苷酶有一定的抑制性，其IC50值為0.540 mg/ml，本研究為進一步探討IgY在動物體內(nèi)的降糖效果和降糖作用機制奠定基礎(chǔ)。

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[收稿2016-06-28 修回2016-08-26]

(編輯 張曉舟)

Preparation,stability and in vitro activity of egg yolk immunoglobulin Y against human Sucrase

SHAO Min,WANG Xin-Ying,LU Yu-Cong,WANG Min，F(xiàn)ENG Kun,WEI Ni-Na，DU Feng-Xia,ZHOU He-Feng.

Department of Bioengineering,Zunyi Medical College Zhuhai Campus,Zhuhai 519041,China

Objective:To prepare the egg yolk immunoglobulin Y (IgY) against human Sucrase and study its stability,in vitro activity.Methods:Hy-line laying hens were immunized with human Sucrase protein,IgY was isolated and purified from egg yolks of immunized hens using water dilution and salting out method.Indirect ELISA was used to evaluate the titer and stability of IgY.The purity and specificity of IgY were analysed by SDS-PAGE and Western blot respectively.The inhibitory effects of IgY on α-glucosidase was studied by PNPG method.Results:Indirect ELISA results showed IgY could be detected on the tenth day after the first immunization,and the peak titer of IgY was 1∶12 800 after the 40th day of immunization.SDS-PAGE showed that the heavy chain and light chain of IgY were 65 kD and 25 kD respectively,and the IgY against human Sucrase could specifically recognize the protein of human Sucrase.The IgY maintained primary titer when it was kept between 29-69℃ for 15 min,and pH 4-7,37℃,4 h.The titer of IgY was maintained 50% after digestion by pepsin and trypsin respectively for 2 hours.IgY had a higher resistence to pepsin than trypsin after longer digestion time.IgY showed an inhibitory effect on α-glucosidase in concentration dependent manner.The half inhibitory concentration (IC50) was 0.540 mg/ml.Conclusion:The IgY against human Sucrase has been successfully obtained,which established foundations for its study of Type 2 diabetes mellitus rat models in vivo.

Sucrase;Hen;IgY;Stability

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.013

①本文受貴州省科技廳基金項目[黔科合SY字(2012)3091]和2010年遵義醫(yī)學(xué)院青年科研啟動基金(F-501)資助。

邵 敏(1978年-),女,碩士,副教授,主要從事分子生物學(xué)研究，E-mail:sm780909@163.com。

及指導(dǎo)教師：周鶴峰(1980年-),男,碩士,教授,主要從事醫(yī)藥生物技術(shù)的研究。

R392.11

A

1000-484X(2016)12-1785-05

②齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病原教研室,齊齊哈爾161000。