SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1炎性體表達中的作用①

王 波 喻思揚 劉 洋 王 燕 徐健強 曾高峰 趙國軍

(南華大學附屬第二醫院心血管內科，衡陽421000)

SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1炎性體表達中的作用①

王 波 喻思揚②劉 洋 王 燕③徐健強 曾高峰 趙國軍④

(南華大學附屬第二醫院心血管內科，衡陽421000)

目的：探討固醇調節元件結合蛋白1(SREBP1)在阿托伐他汀抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1(NLRP1)炎性體表達中的作用。方法：160 nmol/L佛波酯孵育THP-1細胞12 h，使其分化為巨噬細胞，更換無血清培養基，加入脂多糖和(或)阿托伐他汀進行處理。Real-time PCR檢測細胞中NLRP1、SREBP1 mRNA的表達；Western blot檢測細胞中NLRP1、SREBP1蛋白的表達；檢測SREBP1 siRNA預處理細胞后對阿托伐他汀抑制NLRP1表達的影響。結果：阿托伐他汀能抑制THP-1巨噬細胞NLRP1和SREBP1的mRNA和蛋白的表達；單獨使用SREBP1 siRNA處理細胞可有效抑制NLRP1的表達，且與單獨使用阿托伐他汀無明顯差異；同時使用SREBP1 siRNA和阿托伐他汀處理細胞比單獨使用一種對NLRP1的抑制作用更為顯著。結論：阿托伐他汀可能通過SREBP1途徑抑制NLRP1的表達，進而發揮抗炎效應。

阿托伐他汀；抗炎作用；SREBP1；NLRP1炎性體；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)是一種由脂質代謝紊亂和免疫過度激活共同介導的血管壁慢性炎癥性疾病[1]。與As相關的心腦血管事件已經成為了威脅人類健康的重要殺手。阿托伐他汀具有強效降脂作用，臨床上已被廣泛用于As的預防與治療。近年來，有研究發現阿托伐他汀可通過抑制白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)等炎癥因子的分泌，延緩As發展及血栓形成，揭示了阿托伐他汀的抗炎效應[2,3]。但是，其中所涉及的機制目前尚不清楚。

炎性體是一種細胞內的多蛋白寡聚體，參與機體免疫應答和炎癥反應，其活化后可介導半胱天冬酶-1加工前體IL-1β和前體IL-18，使他們轉化為成熟的炎癥因子[4]。作為最早被發現的炎性體，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1，NLRP1)炎性體廣泛存在于巨噬細胞內，并在As中扮演著關鍵角色[5]。固醇調節元件結合蛋白1(Sterol regulatory element binding protein-1，SREBP1)亦是As的重要參與者，它不僅能促進巨噬細胞內脂質的合成，還能調控NLRP1的表達[6]。本研究旨在探討阿托伐他汀能否通過SREBP1途徑抑制NLRP1的表達，剖析阿托伐他汀的抗炎機制，以期為As的防治帶來新的啟示。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑 人單核細胞系THP-1細胞購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞中心；RPMI1640培養基、胎牛血清、佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)購自Sigma公司；阿托伐他汀鈣購自大連美侖生物技術有限公司；RNA抽提試劑購自GeneCopoeia公司；Reverse Transcription System購自Promega公司；TaqMan?Gene Expression Mast-er Mix購自Applied Biosystems公司；NLRP1、SREBP1、β-actin引物均為生工生物工程(上海)股份有限公司產品；NLRP1兔抗人一抗購自Life technologies公司；SREBP1兔抗人一抗購自BioVision公司；β-actin兔抗人一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自ImmuneChem公司；jetTEI轉染試劑購自Polyplus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將THP-1細胞接種在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中(含青霉素和鏈霉素各1.0×105U/L)，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱內培養。培養2～4代后，將狀態良好、呈對數生長的細胞轉種于6孔細胞培養板中。每次實驗前用終濃度為160 nmol/L的PMA處理細胞12 h，誘導其分化成巨噬細胞后，更換無血清培養基，按照實驗分組，予以相應處理因素。

1.2.2 Real-time PCR檢測細胞中NLRP1、SREBP1 mRNA的表達 收集經各種因素處理后的THP-1細胞，使用Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA后，使用Roche LightCycler? 96熒光定量儀進行Real-time PCR。反應條件：95℃ 5 min，95℃ 15 s，65℃ 35 s，進行40個循環。分析基因擴增的平均Ct值，以β-actin為內參，采用公式2-ΔΔCt計算各目的基因的相對表達量。各基因引物序列如下：NLRP1上游引物為5′-CCACAACCCTCTGTCTACATTAC-3′，下游引物為5′-GCCCCATCTAACCCATGCTTC-3′；SREBP1上游引物為5′-CGGCGCTGCTGACCGACATC-3′，下游引物為5′-CCCTGCCCCACTCCCAGCAT-3′；β-actin上游引物為5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，下游5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。

1.2.3 Western blot檢測細胞中NLRP1、SREBP1蛋白的表達 收集經各種因素處理后的細胞樣本，PBS洗滌后加入含PMSF的細胞裂解液，冰上放置30 min，4℃ 12 000 r/min離心5 min后，取上清保存于-20℃冰箱備用。將上清與4×SDS上樣緩沖液按3∶1比例混勻，煮沸5 min后進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，然后轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗，37℃孵育1 h，TBST反復洗滌后加入二抗，37℃孵育2 h，TBST反復洗滌后使用ECL試劑盒進行化學發光檢測。

1.2.4 SREBP1 siRNA轉染 在GenBank中查找人SREBP1 mRNA基因序列，按照siRNA的設計原則設計引物(正義鏈序列為5′-UGACUUCCCUGGCCUAUUUUU-3′；反義鏈序列為5′-AAAUAGGCCAGGGAAGUCAUU-3′)，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將狀態良好、處于對數生長期的THP-1細胞轉種于6孔細胞培養板中，經PMA誘導分化為巨噬細胞。參照Polyplus公司的jetTEI轉染試劑說明書，將siRNA加入各孔內，置于培養箱中孵育6 h后，更換新鮮培養基繼續孵育48 h，采用Western blot確認干擾效果。

2 結果

2.1 阿托伐他汀對THP-1巨噬細胞NLRP1表達的影響 THP-1巨噬細胞經10 ng/ml LPS或(和)10 μmol/L阿托伐他汀孵育24 h后，提取總RNA和總蛋白，分別采用熒光定量PCR和Western blot檢測細胞內NLRP1的mRNA(圖1A)和蛋白(圖1B)表達。結果顯示：與對照組比較，LPS組NLRP1的mRNA和蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與單純LPS組比較，LPS+阿托伐他汀組NLRP1的mRNA和蛋白表達顯著減少(P<0.05)，表明阿托伐他汀可抑制LPS誘導的THP-1巨噬細胞NLRP1的表達。

2.2 阿托伐他汀對THP-1巨噬細胞SREBP1表達的影響 以10 ng/ml LPS及不同濃度(1、10、100 μmol/L)的阿托伐他汀處理THP-1巨噬細胞24 h，提取總RNA和總蛋白，分別采用熒光定量PCR和Western blot檢測細胞內SREBP1的mRNA(圖2A)和蛋白(圖2B)表達。結果顯示：與對照組比較，LPS組SREBP1的mRNA和蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與單純LPS組比較，LPS+阿托伐他汀共處理細胞可使SREBP1的mRNA和蛋白表達顯著下降(P<0.05)，且阿托伐他汀濃度越大，下降越明顯，表明阿托伐他汀可呈濃度依賴性抑制THP-1巨噬細胞SREBP1的表達。

圖1 阿托伐他汀對THP-1巨噬細胞NLRP1表達的影響Fig.1 Effect of atorvastatin on NLRP1 expression in THP-1 macrophagesNote:Compared with untreated control group,* .P<0.05;compared with LPS group,# .P<0.05.n=3.

圖2 阿托伐他汀對THP-1巨噬細胞SREBP1表達的影響Fig.2 Effect of atorvastatin on SREBP1 expression in THP-1 macrophagesNote:Compared with untreated control group,* .P<0.05;compared with LPS group,# .P<0.05.n=3.

同樣，以10 ng/ml LPS及10 μmol/L阿托伐他汀孵育THP-1巨噬細胞不同時間(12、24、48 h)，提取總RNA和總蛋白，分別采用熒光定量PCR和Western blot檢測細胞內SREBP1的mRNA(圖2C)和蛋白(圖2D)表達。結果顯示：與對照組比較，LPS組SREBP1的mRNA和蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與單純LPS組比較，LPS+阿托伐他汀共處理細胞可使SREBP1的mRNA和蛋白表達顯著下降(P<0.05)，且阿托伐他汀作用時間越長，下降越明顯，表明阿托伐他汀可呈時間依賴性抑制THP-1巨噬細胞SREBP1的表達。

2.3 SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1表達中的作用 為了進一步研究SREBP1在阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細胞NLRP1表達中的作用，我們轉染SREBP1 siRNA以沉默SREBP1的表達(圖3A)，然后觀察其對細胞內NLRP1 mRNA(圖3B)和蛋白(圖3C)表達的影響。結果顯示：LPS可使NLRP1的表達顯著增加(P<0.05)；而單獨使用SREBP1 siRNA處理細胞可有效抑制LPS誘導的NLRP1表達(P<0.05)，且與單獨使用阿托伐他汀無明顯差異；此外，同時使用SREBP1 siRNA和阿托伐他汀處理細胞比單獨使用一種對NLRP1的抑制作用更為顯著(P<0.05)。

圖3 SREBP1 siRNA對阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細胞NLRP1表達的影響Fig.3 Effect of SREBP1 siRNA on atorvastatin-induced reduction of NLRP1 expression in THP-1 macrophagesNote:Compared with LPS group,* .P<0.05;compared with LPS+ATO group,# .P<0.05;compared with LPS+SREBP1 siRNA,△.P<0.05.n=3.

3 討論

炎癥在As發生發展中起重要作用。阿托伐他汀已被證實可以下調高敏C-反應蛋白等機體炎癥標記物的水平，發揮抗炎作用，進而降低心血管風險[7]。然而，目前關于阿托伐他汀抗炎機制的報道則相對甚少。本研究以THP-1源性巨噬細胞為研究對象，首先論證了阿托伐他汀可明顯抑制NLRP1的mRNA和蛋白表達；其次，我們觀察了阿托伐他汀對NLRP1上游轉錄因子SREBP1表達的影響，結果顯示阿托伐他汀亦可抑制SREBP1的mRNA和蛋白表達，且這種效應呈濃度和時間依賴性；此外，為了進一步研究SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1表達中的作用，我們運用siRNA對SREBP1進行沉默，發現SREBP1 siRNA和阿托伐他汀同時處理細胞比單獨使用一種對NLRP1的抑制作用更為顯著。因此，我們推斷阿托伐他汀可能通過SREBP1途徑抑制NLRP1的表達，進而發揮抗炎效應。

NLRP1炎性體幾乎存在于所有哺乳動物的細胞內，作為機體固有免疫系統的重要組成部分，其不僅可被LPS、胞壁酰二肽等細菌蛋白激活，啟動宿主抗病原反應，而且還參與白癜風、風濕性關節炎和系統性硬化病等自身免疫性、炎癥性疾病的發生發展[8]。此外，越來越多的研究發現NLRP1炎性體亦與As密切關聯。周圍動脈疾病(Peripheral arterial disease，PAD)是一種多發于老年人的As疾病，常累及下肢，可誘發心臟病和腦卒中。研究顯示NLRP1炎性體的過度激活貫穿PAD始終，除了參與早期的內皮紊亂和炎癥反應外，其亦與后期的血管再生和組織修復密不可分[9]。阿司匹林可有效對抗氧化應激介導的內皮功能紊亂，并能抑制與血小板相關的炎癥反應，是治療PAD的經典藥物之一。近期有學者指出，阿司匹林可顯著降低PAD患者的NLRP1水平，這進一步證實了NLRP1炎性體與As的關聯性，并為標靶NLRP1炎性體治療As提供了理論依據[10]。我們的實驗結果顯示LPS可使THP-1巨噬細胞NLRP1的mRNA和蛋白表達顯著上調，且這種效應能被阿托伐他汀明顯削弱，提示阿托伐他汀可抑制NLRP1的表達，但是，阿托伐他汀是通過何種途徑作用于NLRP1，目前尚不清楚。

固醇調節元件結合蛋白(Sterol regulatory element binding protein，SREBP)是一類存在于哺乳動物細胞內、參與調節細胞脂質水平的轉錄因子，包括SREBP1和SREBP2[11]。其中SREBP1已被證實是NLRP1上游重要的調控因子，SREBP1基因的缺失可導致巨噬細胞NLRP1的表達和下游炎癥因子的合成顯著減少[6]。有研究發現阿托伐他汀可通過SREBP1途徑調節脂質代謝、改善內皮功能紊亂，從而延緩As的發生發展[12,13]。與之相符，我們的實驗結果顯示阿托伐他汀能有效抑制LPS誘導的THP-1巨噬細胞SREBP1的表達，且這種效應呈濃度和時間依賴性。此外，為了進一步研究SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1表達中的作用，我們通過轉染SREBP1 siRNA以沉默THP-1巨噬細胞內SREBP1的表達，結果發現SREBP1表達下調后，NLRP1的表達水平亦明顯下降，且這種效應與單獨使用阿托伐他汀無明顯差異；另外，我們還發現同時使用SREBP1 siRNA和阿托伐他汀處理細胞比單獨使用一種對NLRP1的抑制作用更為顯著。因此我們推斷阿托伐他汀很可能通過SREBP1途徑抑制NLRP1的表達。然而，關于阿托伐他汀是否亦能通過其他途徑作用于NLRP1炎性體，目前不甚清楚。

綜上所述，NLRP1炎性體是機體固有免疫應答和炎癥反應的重要調節器，參與As發生發展。本研究顯示阿托伐他汀可能通過SREBP1途徑抑制NLRP1的表達，在一定程度上闡明了阿托伐他汀的抗炎機制。但是，近期有文獻報道SREBP1與核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性體的激活密切相關[14]。考慮到NLRP3炎性體在As中的作用尚存爭議[9,15]，且SREBP2已被證實是NLRP3炎性體主要的上游調控因子[16,17]，故本文并未涉及SREBP2-NLRP3途徑的有關內容。隨著對炎性體及其上游調控機制研究的不斷發展，我們將更全面、更深入地了解As的發病機制，為As的早期診斷、預防和治療帶來新的啟示。

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[收稿2016-03-09]

(編輯 倪 鵬)

Role of SREBP1 in atorvastatin-induced reduction of NLRP1 inflammasome expression

WANG Bo,YU Si-Yang,LIU Yang,WANG Yan,XU Jian-Qiang,ZENG Gao-Feng,ZHAO Guo-Jun.

Department of Cardiovascular Medicine,the Second Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang 421000,China

Objective:To investigate the role of sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP1) in atorvastatin-induced reduction of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1 (NLRP1) inflammasome expression.Methods:THP-1 cells were treated with phorbol 12-myristate 13-acetate (160 nmol/L) for 12 h to be differentiated into macrophages.The medium was then replaced with serum-free medium containing lipopolysaccharide and (or) atorvastatin.The mRNA expression of NLRP1 and SREBP1 were detected by Real-time PCR.The protein expression of NLRP1 and SREBP1 were determined by Western blot.Furthermore,we observed the effect of SREBP1 siRNA on atorvastatin-induced reduction of NLRP1 expression.Results:Atorvastatin inhibited the mRNA and protein expression of NLRP1 and SREBP1 in the THP-1 macrophages.SREBP1 siRNA showed no significant difference on lowering NLRP1 expression when compared with atorvastatin.Treating cells with SREBP1 siRNA and atorvastatin at the same time resulted in more obvious reduction of NLRP1 expression than single use of SREBP1 siRNA or atorvastatin.Conclusion:Atorvastatin might exert anti-inflammatory effect by repressing NLRP1 expression through the SREBP1 pathway.

Atorvastatin;Anti-inflammatory effect;SREBP1;NLRP1 inflammasome;Atherosclerosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.018

王 波(1977年-)，男，碩士，主治醫生，主要從事動脈粥樣硬化病因與防治方面研究，E-mail：653139732@qq.com。

及指導教師：曾高峰(1968年-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事動脈粥樣硬化病因與防治方面的研究，E-mail：2379795177@qq.com。 趙國軍(1978年-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事動脈粥樣硬化病因與防治方面的研究，E-mail：zzhcsu@163.com。

R392.5

A

1000-484X(2016)12-1805-05

①本文為湖南省自然科學基金(No.14JJ5016)。

②共同第一作者。

③南華大學附屬第二醫院麻醉科，衡陽421000。

④桂林醫學院組胚教研室，桂林541004。