真菌免疫調節蛋白結構與功能的研究進展

帖衛芳，賈俊忠，郭文平

(1.河套學院醫學系，內蒙古巴彥淖爾 015000；2.巴彥淖爾市醫院，內蒙古巴彥淖爾 015000；3.西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌 712100)

真菌免疫調節蛋白結構與功能的研究進展

帖衛芳1，賈俊忠2，郭文平3

(1.河套學院醫學系，內蒙古巴彥淖爾 015000；2.巴彥淖爾市醫院，內蒙古巴彥淖爾 015000；3.西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌 712100)

真菌免疫調節蛋白是一類具有多種生物學功能的小分子蛋白質。介紹了已發現真菌免疫調節蛋白的序列特性及結構，并對其生物學功能的最新研究進展進行了綜述，最后對其今后的發展趨勢進行了展望。

真菌免疫調節蛋白；結構；生物學功能

在傳統中醫藥中，許多真菌作為藥物被廣泛使用；在民間，人們也通過食用真菌來增強自身的免疫力。隨著現代科學技術的發展，已經從真菌中分離到許多與提高人體免疫力密切相關的生物活性物質，主要包括多糖、肽、蛋白質、糖蛋白、甾醇、萜類、維生素等。在提取的生物活性蛋白質中，凝集素與真菌免疫調節蛋白(Fungal immunomodulatory protein，Fip)是2種重要的具有免疫調節功能的蛋白。真菌免疫調節蛋白是一類從高等擔子菌中分離出來的具有免疫調節活性的小分子蛋白質，最早由日本學者Kino等[1]從赤靈芝(Ganodermalucidum)中分離純化到，并將其命名為Ling Zhi-8(LZ-8)。最初，真菌免疫調節蛋白的研究主要集中在可食用的真菌；在隨后的20多年中，更多的真菌免疫調節蛋白被發現，包括一些非食用的真菌。研究發現，該類蛋白具有包括抗腫瘤活性和免疫調節功能在內的多種生物學功能。筆者介紹了已發現真菌免疫調節蛋白的序列特性及其結構，并對其生物學功能的最新研究進展進行了綜述，最后對其今后的發展趨勢進行了展望。

1 真菌免疫調節蛋白的來源及特征

1989年，日本學者Kino等[1]對赤靈芝菌絲體的粗提取物進行進一步純化，經過凝膠過濾及離子交換層析，得到了一種等電點為4.4的蛋白質，Tricine-SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳結果表明其分子量約為13 kD。該蛋白能刺激小鼠脾淋巴母細胞的形成，命名為LZ-8，這是第1個從真菌中分離到的真菌免疫調節蛋白。Tanaka等[2]對該蛋白進行了測序，測序結果表明成熟的LZ-8是由110個氨基酸殘基組成的，其氨基端為乙?；慕z氨酸，根據其氨基酸組成，推導其分子量為12.4 kD，與試驗結果相一致。1991年，Murasugi等[3]從靈芝的 cDNA 文庫中篩選到LZ-8蛋白的編碼基因，不包括終止密碼子的堿基長度為333 bp，根據該基因核苷酸序列推導的氨基酸序列與蛋白質測序結果完全一致，只比成熟的LZ-8多1個甲硫氨酸(Met)。

除了赤靈芝中分離到的LZ-8外，學者也從小孢子靈芝(G.microsporum)[4]、金針菇(Flammulinavelutipes)[5]、草菇(Volvariellavolvacea)[6]和松杉靈芝(G.tsugae)[7]中分離到真菌免疫調節蛋白，分別被命名為Gmi、FIP-fve、FIP-vvo和FIP-gts。迄今為止，NCBI 網站上公布的免疫調節蛋白的完整序列共有15種，分別來自赤靈芝(G.lucidum，P14945)[1]、紫靈芝(G.japoncium，AAX98241)、小孢子靈芝(3KCW_A)[4]、松杉靈芝[7]、樹舌靈芝(G.applanatum，AEP68179)[8]、黑靈芝(G.atrum，AJD79556)[9]、紫芝(G.sinense)[10]、草菇[6]、云芝(Trametesversicolor，XP_008038009)[11]、污叉絲孔菌(Dichomitussqualens，XP_007362866)、金針菇(P80412)[5]、色釘菇(Chroogomphusrutilus，AKU37620)[12]、褐腐菌(Postiaplacenta，AJL35148.1)[13]、臺灣樟芝(Taiwanofunguscamphoratus，AAT11911)[14]和銀耳(Tremellafuciformis，ABL96299)[15]。以上這些真菌免疫調節蛋白由111～136個氨基酸組成，其中最長的來自臺灣樟芝，為136個氨基酸，與其他真菌來源的免疫調節蛋白的同源性低于20%。除了來自臺灣樟芝的免疫調節蛋白外，銀耳中發現的免疫調節蛋白與其他真菌來源的免疫調節蛋白的同源性甚至更低，約為10.0%。其他真菌來源的免疫調節蛋白的同源性為44.5%～100%，其中赤靈芝與松杉靈芝來源的免疫球蛋白的氨基酸序列完全一致。在真菌的Ganoderma屬中，其他物種來源的氨基酸同源性為80.2%～86.5%。除了LZ-8外，葉波平等[16]從赤靈芝中分離到3種具有促進淋巴細胞增殖活性的蛋白質，但其分子量遠大于LZ-8；這也表明靈芝中存在多種與免疫調節相關的生物活性物質。因此，據此推測來源于臺灣樟芝和云芝中的真菌免疫調節蛋白可能與其他真菌中來源的免疫調節蛋白不屬于同一個家族。Pushparajah等[17]報道了Lignosusrhinocerotis中的真菌免疫調節蛋白FIP-lrh，它與LZ-8的同源性最高，為64%。

2 真菌免疫調節蛋白的結構

目前已發現的大部分真菌免疫調節蛋白具有較高的同源性，因此其蛋白質的一級結構非常相似。在氨基酸組成上，除了臺灣樟芝和云芝外，源自其他真菌的免疫調節蛋白不含組氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)，但是卻富含天冬氨酸(Asp)和纈氨酸(Val)，并且其中的28個氨基酸完全相同，其中FDYTP 5個氨基酸殘基高度保守。在已發現的真菌免疫調節蛋白中，LZ-8為糖蛋白，其他均不含糖。經過凝膠過濾與層析純化后的LZ-8含糖量為1.3%，再經過高效液相色譜純化后，其含糖量降至0.6%，僅檢測到少量的甘露糖與氨基己糖[1]。

LZ-8是第1個被發現的真菌免疫調節蛋白，Tanaka等[2]發現LZ-8與幾種免疫球蛋白重鏈的可變區具有一定的同源性，如鼠的AVMS67和A1MS47、人的G1HUHL，甚至還包括低等脊椎動物金魚的G6A。在NBRF數據庫中，LZ-8與AVMS67(鼠IgA重鏈的可變區)的同源性最高，AVMS67、 A1MS47、G1HUHL、G6A與LZ-8中28%的氨基酸完全相同，其中11%的氨基酸殘基非常保守，主要包括Tyr/Phe、Ser/Thr、Lys/Arg、Asp/Glu、Ile/Leu或Val。

由于氨基酸組成的高度同源，因此真菌免疫調節蛋白也應該具有類似的二級結構與高級結構。Tanaka等[2]也對LZ-8的二級結構進行了分析，發現其富含β-折疊，對其二級結構的預測發現LZ-8可能含有7個β-折疊。Lin等[7]也對松杉靈芝中FIP-gts的二級結構進行了預測，結果表明其二級結構包括2個α-螺旋、7個β-折疊以及1個β-轉角(圖1)。Zhou等[10]推測紫芝中FIP-gsi的二級結構與FIP-gts相似，包括2個α-螺旋、7個β-折疊以及1個β-轉角。Pushparajah等[17]推測FIP-lrh的二級結構至少包括1個α-螺旋與7個β-折疊。Ko等[5，18]發現金針菇免疫調節蛋白FIP-fve與LZ-8和FIP-gts有相似的二級結構，由3個α-螺旋、6個β-折疊以及1個β-轉角組成，不同的是FIP-gts 3’端的β-折疊在FIP-fve中變成了α-螺旋。Lin等[7]利用酵母雙雜交和點突變的方法研究發現，真菌免疫調節蛋白N端約10個氨基酸的α-螺旋結構對二聚體的形成以及其識別靶細胞表面受體發揮生物學功能至關重要。將真菌免疫調節蛋白與免疫球蛋白A重鏈可變區的二級結構進行比較，發現二者在相似的區域形成β-折疊，只是后者可形成9個β-折疊。

2003年，Seow等[19]采用懸滴法獲得了金針菇真菌免疫調節蛋白FIP-fve的晶體，并用X-射線對其晶體結構進行了分析，發現其為二聚體結構。2003年，Paaventhan等[20]對金針菇真菌免疫調節蛋白的結構進行了研究，利用NaBr滲透對該蛋白進行單項不規則晶體衍射，進一步證實了FIP-fve為二聚體結構，其分子結構類似“啞鈴型”。研究發現，2個單體各自N端的α-螺旋(HA和HB)通過疏水作用結合到一起，分別與之鄰近的2個反向平行的β-折疊結構(SA和SB)通過氫鍵結合到一起形成了β片層。每個單體中的其他β-折疊依靠分子間的氫鍵形成β片層，圖2中的E-B-A形成1個片層，G-F-C-C’形成另一個片層，與免疫球蛋白樣折疊(Ig-like fold)相似，被稱為FNⅢ型折疊。該折疊是一種7個β折疊-s型與8個β折疊-h型的中間過渡結構。這種結構又被稱為“假-h型拓撲結構”構型，這種構型廣泛存在于很多功能蛋白質中，卻是首次在真菌免疫調節蛋白中被發現。真菌免疫調節蛋白的N端大部分是疏水氨基酸，還不存在半胱氨酸，而不能形成二硫鍵，因此疏水作用是維持2個單體N端的α螺旋形成二聚體的主要作用力。2009年，Huang等[21]分析了赤靈芝中LZ-8的晶體結構，發現其也是由2個單體形成的同源二聚體，與FIP-fve的FNIⅡ型折疊類似，β折疊A-B-E與G-F-C-D分別形成2個片層。2007年，Wu等[4]研究發現小孢子靈芝中的真菌免疫調節蛋白FIP-gmi的晶體結構為同源四聚體(圖3)。

圖1 FIP-gts(B)[7]的氨基酸序列與二級結構Fig.1 Amino acid sequences and the secondary structure of FIP-gts(B)

3 真菌免疫調節蛋白的生物學功能

3.1 凝集血紅細胞 迄今為止，已研究的幾種真菌免疫調節蛋白都可以凝集哺乳動物的血紅細胞，并且凝集能力一般較強，低濃度的蛋白就可以產生明顯的凝集效果。雖然每種真菌免疫調節蛋白凝集血細胞的活性不具有種屬特異性，但也具有選擇性，并不是每種真菌免疫調節蛋白可以凝集所有動物的紅細胞。Kino等[1]研究發現從菌絲體中分離純化的天然LZ-8可以凝集綿羊血紅細胞，最小凝集濃度為6.25 μg/mL。Liang等[22]在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中重組表達了LZ-8，發現其能凝集綿羊血紅細胞，最小凝集濃度為12.5 μg/mL。Xue等[23]研究發現10.0 μg/mL的重組表達LZ-8才可以凝集小鼠血紅細胞。Lin等[24]研究發現3.13 μg/mL重組表達的LZ-8就能凝集綿羊血紅細胞。但是，天然的LZ-8與重組表達的LZ-8均不能凝集人的4種血細胞。低劑量的FIP-vvo就可以凝集大鼠(0.52 μg/mL)、小鼠(1.10 μg/mL)和兔(0.13 μg/mL)的血紅細胞，但不能凝集人的血紅細胞[6]。然而，Ko等[5，18]研究發現FIP-fve(大于2.00 μg/mL)可以凝集人的血紅細胞。Pushparajah等[17]研究發現0.34 μmol/L原核表達的FIP-lrh可以凝集人和小鼠的血紅細胞。Li等[13]原核重組表達了褐腐菌的真菌免疫調節蛋白FIP-ppl，發現64 μg/mL的表達產物能夠凝集兔子的血紅細胞，但高濃度的FIP-ppl也不能凝集人的血紅細胞。一般而言，一些簡單的寡糖或糖復合物可以抑制凝集素的血細胞凝集活性，但卻不能抑制真菌免疫調節蛋白的[6]，表明這2種蛋白凝集血紅細胞的機制應該不同，據此推測真菌免疫調節蛋白可能特異的識別比多糖更為復雜的寡糖連[25]。

圖2 FIP-fve(A)[19]與LZ-8[21](B)的晶體結構Fig.2 The crystal structure of FIP-fve(A)and LZ-8(B)

圖3 FIP-gmi晶體的四聚體結構[4]Fig.3 The tetramer structure of Fip-gmi crystal

3.2 促進淋巴細胞增殖 研究發現，真菌免疫調節蛋白可以促進小鼠脾細胞和人外周血淋巴細胞的有絲分裂。Kino等[1]在培養的鼠脾細胞中加入LZ-8，然后以放射性同位素[3H]的增加來檢測鼠脾細胞的增殖情況，發現[3H]隨著LZ-8量的增加而增加，表明LZ-8可以促進鼠脾細胞的有絲分裂。當LZ-8的量達到3.13 μg/mL，鼠脾細胞的增殖達到最大，隨著LZ-8量的進一步增加，鼠脾細胞的增殖反而下降，表明LZ-8促進脾細胞的有絲分裂呈現出劑量效應。重組表達的LZ-8也具有促進鼠脾細胞增殖的作用[23-24]。Hsu等[6]采用放射性同位素[3H]的方法證實FIP-vvo可以促進人外周血淋巴細胞的增殖，促進人外周淋巴細胞增殖的最大濃度為5.0 μg/mL。Ko等[5]研究發現FIP-fve促進人外周血淋巴細胞的增殖效果不如LZ-8和FIP-vvo，當其濃度為100.0 μg/mL時最能促進人外周淋巴細胞的增殖。Wang等[26]研究發現，高濃度的FIP-fve可以促進人外周血淋巴細胞的有絲分裂，促進細胞周期從G1/G0期向S期的轉化。Li等[13]研究發現2.0 μg/mL的FIP-ppl可以最大程度促進鼠脾細胞的增殖。Haak-Frendscho等[27]和van der Hem等[28]研究LZ-8對人外周淋巴細胞增殖的促進機制，發現LZ-8先是激活巨噬細胞和T淋巴細胞誘導產生產生細胞因子和α腫瘤壞死因子，這些因子進而會促進人外周淋巴細胞的增殖。

3.3 抗過敏與Arthus反應 小鼠的活體試驗表明，真菌免疫調節蛋白可以抑制其系統過敏與Arthus反應。當給小鼠經皮下或腹腔注射牛血清蛋白使其致敏，對照組小鼠均出現過敏反應，而注射了LZ-8和FIP-fve的試驗組小鼠均不表現出過敏癥狀，表明這2種真菌免疫調節蛋白具有完全抑制過敏反應的作用[1，5]。然而，Hsu等[6]發現注射了FIP-vvo的試驗組小鼠大部分出現了過敏癥狀，抑制過敏反應的作用不如LZ-8和FIP-fve。當用牛血清蛋白或48/80復合物注射小鼠的足墊，小鼠就會發生Arthus反應而足墊出現水腫。當再給小鼠的足墊注射以上3種真菌免疫調節蛋白后，小鼠足墊的水腫就會減弱，表明真菌免疫調節蛋白可以減弱Arthus反應[1，5-6]。Kino等[29]用乙肝病毒的表面抗原免疫小鼠，同時給小鼠腹腔注射LZ-8，發現LZ-8可以抑制小鼠產生抗體，因此認為這是LZ-8抑制系統過敏與Arthus反應的原因。Hsu等[6]研究發現，與LZ-8和FIP-fve誘導Th1產生IFN-γ與IL-2相比，FIP-vvo不僅可以誘導Th1產生IFN-γ與IL-2，而且可以誘導Th2產生IL-4，而IL-4進一步促進B淋巴細胞增殖與分化，最終釋放IgE。這也解釋了FIP-vvo不能有效抑制過敏與Arthus反應的原因。Hsieh等[30]發現口服FIP-fve可以抑制小鼠因食用卵清蛋白而引起的過敏反應。Liu等[31]研究發現FIP-fve可以抑制羽刺皮癬螨2型抗原引起的呼吸道炎癥。

3.4 抗腫瘤作用 藥用真菌具有顯著的抗腫瘤作用，并且發現真菌中提取的混合蛋白可以有效抑制腫瘤，因此藥用真菌越來越得到學者們的重視[32]。近年來研究表明，真菌免疫調節蛋白具有良好的抗腫瘤作用，受到越來越多的關注，而且發現其抗腫瘤的機制具有多樣性。

2006年，Chang等[33]報道給患肝癌的小鼠口服FIP-fve表現出明顯的抗腫瘤作用，抑制腫瘤的生長，明顯延長了其壽命，其機制是通過激活機體的特異性與非特異性免疫應答，進而增強巨噬細胞和腹腔細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。Li等[13]研究發現FIP-ppl可以誘導胃癌細胞MGC823與肝癌細胞HepG2的凋亡，進而發揮其抗腫瘤的作用。

在真菌免疫調節蛋白抗腫瘤方面，Liao等[34]研究發現原核重組表達的FIP-gts可以抑制人肺癌細胞A549的生長，其機制可能是c-myc轉錄因子結合在人端粒酶逆轉錄酶的啟動子上，抑制其轉錄進而抑制逆轉錄酶的表達，從而發揮其抗腫瘤的作用。2007年，Liao等[35]研究發現FIP-gts進入細胞后定位在內質網從而誘導內質網應激，引起鈣離子的釋放而激活鈣離子依賴的信號通路，抑制人端粒酶逆轉錄酶從細胞核進入細胞質進而抑制端粒酶活性。2008年，Liao等[36]發現原核重組表達的FIP-gts可以阻止A549的細胞周期，使其停滯在G1期，進而降低細胞的生長和表現出抗腫瘤活性。2014年，Li等[37]研究發現FIP-gts可以促進順鉑耐藥的尿路上皮癌細胞發生自噬。此外，Wang等[38]研究發現人1型非轉移性克隆23基因與FIP-gts協同作用可增強其對癌細胞遷移的抑制作用。

Lin等[24]研究發現酵母中重組表達的LZ-8對人類白血病NB4具有明顯的殺傷作用，當其濃度為16.0 μg/mL時起抑制作用，抑制率為38.5%，表現出一定的抗癌活性，其機制為引起細胞發生凋亡。2011年，Wu等[39]研究發現重組的LZ-8使細胞周期在G1期停止并阻止細胞的生長；此外，重組的LZ-8還可以抑制移植Lewis肺癌細胞小鼠的癌細胞的生長。這些研究表明，重組表達的LZ-8在體內試驗與體外試驗中均能抑制癌細胞的生長，其機制為LZ-8引起核糖體應激促進p53的表達，p53又抑制細胞周期的進行使細胞停滯在G1期。Liang等[40]研究發現重組表達的LZ-8可以引起人胃癌細胞SGC-7901的自噬，其機制為LZ-8引起細胞內質網應激和激活ATF4-CHOP途徑，進一步激活泛素/蛋白酶體內質網相關蛋白降解系統，從而引起細胞發生自噬，并且該自噬反應不依賴含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。Cong等[41]研究發現10.0 μg/mL 的LZ-8就能誘導人星形膠質瘤細胞U-251的凋亡，并且抑制其細胞周期從G1期到S期的轉化，因此LZ-8表現出抗人星形膠質瘤細胞U-251的生物學活性。

2010年，Lin等[42]研究發現FIP-gmi可以抑制表皮生長因子介導的EGFR和AKT信號通路的磷酸化與激活、Cdc42 GTPase的激活和微絲解聚，進而抑制A549細胞的遷移和侵襲；同時，Lin等[43]也發現FIP-gmi可以下調腫瘤壞死因子α介導的基質金屬蛋白酶9的表達，進而抑制A549細胞的遷移和侵襲。Hsin等[44-45]研究發現，無論在體內試驗還是體外試驗中，FIP-gmi均可以誘導肺癌細胞發生自噬而引起細胞死亡。Chiu等[46]研究發現，FIP-gmi通過抑制Akt-mTOR-p70S6K 細胞信號通路而誘導多重耐藥肺癌細胞的自噬。然而，Hsin等[47]在肺癌細胞中研究發現FIP-gmi引起的細胞自噬可以增強順鉑誘導癌細胞的凋亡。

3.5 其他生物學功能 除了生物學活性外，Kino等[48]發現靈芝真菌免疫調節蛋白LZ-8可以抑制自主免疫性糖尿病的發生，腹腔注射LZ-8試驗小鼠的胰腺沒有炎癥并且分泌胰島素的細胞數量正常，然而未經LZ-8處理的對照組小鼠表現出胰腺炎和分泌胰島素的細胞數量減少，并且表現出糖尿病臨床癥狀。van der Hem等[28，49]研究發現LZ-8可以增加異體皮膚移植小鼠的存活時間。此外，還發現LZ-8可以延緩胰臟移植排斥反應的發生和延長該小鼠的存活期，持續地給小鼠使用LZ-8可以進一步延長其生存時間，且不會產生毒副作用。

Wang等[26]研究發現，真菌免疫調節蛋白FIP-fve能夠誘導人外周血淋巴細胞黏附分子-1(ICAM-1)的表達，適量的FIP-fve對ICAM-1的產生有明顯的促進作用，呈現出劑量依賴關系。Miyasaka等[50]研究發現LZ-8主要選擇性地提高U937細胞系CD11b的表達，并且存在劑量依賴性；LZ-8可以誘導血管內皮細胞ICAM-1的表達，顯著增強IFN-r誘導的血管內皮細胞和U937細胞的相互黏合；可以選擇性地促進MOLT4細胞上CD2的表達；促進人T細胞與羊血紅細胞的玫瑰花結的形成。因此，LZ-8可以通過調節黏附分子的表達而促進細胞間的相互作用。

4 展望

藥用、食用真菌在我國民間的應用已有1 000多年，在其他一些亞洲國家其相關的應用也有悠久的歷史，但對其研究大多停留在多糖以及一些小分子次生代謝物上，雖然也有一些應用于臨床的案例，但并不廣泛。隨著分子生物學和生物工程技術的飛速發展，利用藥用、食用真菌培養獲得大量重組免疫調節蛋白的研究取得了較好的進展。此外，學者已經對真菌免疫調節蛋白的結構和功能進行了深入研究，這將為有效利用真菌資源探索能提高人體免疫力的功能食品和新型免疫調節蛋白藥物奠定了基礎。利用基因工程手段可以大量獲得真菌免疫調節蛋白，發現其與天然分離純化的蛋白不僅具有相似的結構而且還表現出相似的生物學功能，因此利用基因工程獲得真菌免疫調節蛋白是一種重要手段和發展的必然趨勢。因此，利用重組表達的真菌免疫調節蛋白，深入研究其功能及作用機制是今后真菌免疫調節蛋白的重要研究方向之一。與此同時，真菌免疫調節蛋白在臨床方面的開發與利用應該得到關注，這也是研究真菌免疫調節蛋白功能的初衷。參考文獻

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Advances of Research on the Structure and Function of Fungal Immunomodulatory Proteins

TIE Wei-fang1, JIA Jun-zhong2, GUO Wen-ping3

(1. Department of Medicine, Hetao University, Bayannur, Inner Mongolia 015000; 2. Inner Mongolia Bayannur City Hospital, Bayannur, Inner Mongolia 015000; 3. College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100)

Fungal immunomodulatory proteins(FIPs)is a kind of low molecular weight proteins with many biological functions. The sequence character and structure of FIPs were introduced， and the latest research progress on its biological functions were reviewed. Finally，its development trend in the future was forecasted.

Fungal immunomodulatory protein；Structure；Biological functions

帖衛芳(1984- )，女，山西大同人，講師，碩士，從事生物化學與分子生物學研究。

2016-11-18

Q 949.32；R 392

A

0517-6611(2016)35-0020-05