不同菌株對鎘的吸附效果

吳 優，徐鳳花，張蘊琦，張書敏

(東北農業大學資源與環境學院，黑龍江哈爾濱 150030)

不同菌株對鎘的吸附效果

吳 優，徐鳳花*，張蘊琦，張書敏

(東北農業大學資源與環境學院，黑龍江哈爾濱 150030)

[目的]篩選對鎘有高耐性的菌株，為探究重金屬污染微生物修復技術提供理論依據。[方法]以DN-1和DN-2為供試菌株，在不同培養時間、培養溫度、pH、鎘離子初始濃度的條件下，研究不同菌株對鎘離子的吸附效果。[結果]培養3 d時菌株DN-1和DN-2對鎘離子的吸附率最大，分別為61.92%和89.57%；2種菌株對鎘離子的最佳吸附溫度為30 ℃。菌株DN-1和DN-2分別在pH為8和6時吸附率最高；鎘離子初始濃度為80～200 mg/L時，DN-2吸附率明顯高于DN-1。透射電鏡觀察發現，與未經處理的菌株相比，經鎘離子處理后的菌株細胞表面及胞內有沉淀物聚集，細胞內部結構發生明顯變化。[結論]菌株DN-1和DN-2對鎘離子具有一定耐受性，吸附效果明顯。胞外吸附和胞內沉淀可能是菌株吸附重金屬的重要途徑。

鎘離子；菌株；吸附率

近年來，隨著人們生活水平的提高，對食品安全的關注日益增強，在影響食品安全的諸多因素中，土壤重金屬污染尤為突出。我國土壤重金屬污染形勢嚴峻，據不完全統計，我國受到鎘、砷、鉛、鉻、汞等重金屬污染的耕地近2 000萬hm2，約占總耕地面積的20%。每年因重金屬污染的糧食達1 200萬t，造成的直接經濟損失超過200億元，在各種重金屬污染中以鎘的污染最為突出。南京農業大學農業資源與生態環境研究所教授潘根興和他的研究團隊，在全國6個地區(華東、東北、華中、西南、華南和華北)縣級以上市場隨機采購大米樣品91個，結果表明，10%左右的市售大米鎘超標[1]。植物吸收富集于土壤中的鎘可使農作物中鎘含量升高，通過食物鏈進入人體。鎘在人體中積蓄的毒性，潛伏期可長達10～30年。因此，治理鎘污染具有重要的現實意義。

與物理、化學和植物修復方法相比，微生物修復技術高效低耗，不會對環境造成二次污染，能夠改善土壤微生物環境，且微生物在物種資源豐富、繁殖速度快、遺傳特性易于改變、易于工業化生產且生產成本低等方面具有獨特優勢，因此具有良好的生態效益和廣闊的應用前景[2-7]。研究表明，微生物對鎘等重金屬具有較好的吸附性。微生物的吸附性能主要由生物量的特性、目標重金屬的物理化學性質及反應發生的小環境(如溶液的初始pH、溫度和其他離子的相互作用)等因素決定，深入研究微生物對重金屬的吸附特性，對于凈化重金屬污染環境具有重要意義[8]。因此，筆者在不同培養時間、培養溫度、pH及鎘離子初始濃度的條件下，篩選對鎘具有高耐性的菌株，以期為重金屬污染修復提供菌種資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 東北農業大學資源與環境學院應用微生物研究室篩選菌株，分別標注為DN-1和DN-2。原子吸收分光光度計(島津A-800)。

1.2 試驗設計 設不同培養時間(1、2、3、4、5 d)，溫度(10、20、30、40 ℃)，pH(4、5、6、7和8)及鎘離子初始濃度(0、80、120、160、200、240 mg/L)，研究其對菌種吸附效果的影響。

空白處理：2個不同菌株分別做1組空白對照，標記為K1、K2。空白對照培養基中不加鎘離子，只加入對應菌株的菌懸液。

1.3 吸附試驗

1.3.1 培養時間對鎘離子吸附的影響。將10 mL菌懸液分別接入含鎘離子160 mg/L(1.42 mmol/L)的溶液中，于30 ℃ 200 r/min搖床培養1、2、3、4、5 d，然后于5 000 r/min離心5 min，取上清液，用火焰原子吸收分光光度計測定鎘離子殘留量。

1.3.2 培養溫度對鎘離子吸附的影響。將10 mL菌懸液分別接入含鎘離子160 mg/L(1.42 mmol/L)的溶液中，在200 r/min搖床分別于10、20、30、40 ℃培養3 d，然后于5 000 r/min離心5 min，取上清液，測定鎘離子殘留量。

1.3.3 pH對鎘離子吸附的影響。用1 mol/L NaOH和HNO3將含鎘離子160 mg/L(1.42 mmol/L)溶液的pH分別調至4、5、6、7、8，以自然pH為對照。將10 mL菌懸液分別接入含鎘離子160 mg/L(1.42 mmol/L)的溶液后置于30 ℃，200 r/min搖床培養3 d，然后5 000 r/min離心5 min，取上清液，測定鎘離子殘留量。

1.3.4 鎘離子初始濃度對菌種吸附的影響。將10 mL不同菌懸液分別接入鎘離子濃度40、80、120、160、200、240 mg/L(0.36～2.14 mmol/L)的溶液中，于30 ℃、200 r/min搖床培養3 d，然后于5 000 r/min離心5 min，取上清液，測定鎘離子殘留量，以不加菌體的鎘離子溶液作為對照。所有試驗均做3次重復。

1.4 鎘標準曲線繪制 將標準溶液分別配制成濃度為1、2、3、4、5 mg/L的鎘離子溶液，用火焰原子吸收分光光度計測定鎘離子濃度，然后繪制標準曲線(圖1)，利用該標準曲線校正儀器誤差(其中檢出限≤0.005 μg/mL，精密度≤1%)。測定前，鎘離子溶液要用去離子水適當稀釋，以確保樣品中鎘離子濃度與吸光度呈線性關系。計算公式：

Q=(C0-C)/C0×100%

式中，C0為溶液中鎘離子的初始濃度；C為經菌體吸附后溶液中鎘離子的濃度；Q為菌種對鎘離子的吸附率。

圖1 鎘離子原子吸收標準曲線Fig.1 Standard curve of atomic absorption of Cd2+

1.5 透射電鏡觀測方法 將樣品菌懸液稀釋至適宜的濃度后用帶支持膜的銅網滴片，然后進行吸附，磷鎢酸染色數分鐘后，用濾紙吸干染液，在37 ℃下干燥0.5 h后置于透射電子顯微鏡下觀察菌體超微形態。

2 結果與分析

2.1 培養時間對鎘離子吸附的影響 從圖2可見，DN-1、DN-2對鎘離子的吸附率隨著培養時間的延長呈先增加后減小的趨勢。DN-2培養2 d后吸附率迅速增大，培養3 d較培養1 d的吸附率高40.66百分點，說明該階段主要是菌株表面的吸附作用，這種作用的特點是快速、可逆、不依賴能量代謝[9]。第3天DN-1和DN-2對鎘離子的吸附率最大，分別為61.92%和89.57%，3 d后吸附率降低，4 d后吸附率趨于平穩。這是由于吸附初期菌體表面空白吸附位點較多，鎘離子可與菌體表面的吸附位點快速結合，隨著吸附時間的延長，吸附位點逐漸飽和，開始進行吸附過程緩慢的胞內吸附。這一規律基本符合“吸附+細胞膜傳輸”模型，即菌體對重金屬的吸附分為2個階段：①不依靠細胞代謝直接結合在細胞表面，這一過程迅速；②依靠細胞代謝向細胞內的傳輸，這一過程緩慢[10]。

圖2 培養時間對鎘離子吸附的影響Fig.2 Effect of culture time on the adsorption of Cd2+

2.2 培養溫度對鎘離子吸附的影響 從圖3可見，DN-1和DN-2對鎘離子的吸附率隨培養溫度的升高呈先增大后減小的趨勢。當溫度低于30 ℃時，DN-1、DN-2對鎘離子的吸附率隨著溫度的增加而迅速增大，30 ℃時吸附率最大，為61.04%和89.57%，較10 ℃時分別增加24.24%和58.80%。這可能是由于在高溫條件下，菌體的一些吸附位點被活化，吸附位點數量增加，此外生物吸附是吸熱反應過程，溫度升高也有利于吸附平衡向吸熱方向移動[11]。在高溫條件下，菌體的一些吸附位點被活化，吸附位點數量增加；當溫度高于30 ℃，隨著溫度的增加菌株對鎘離子的吸附率大幅度下降，40 ℃時較最大吸附率分別降低13.05和22.69百分點，表明高溫條件抑制了菌株對鎘離子的吸附。贠妮等[12]研究表明，鎘的吸附與菌體的生長有關，溫度過高不利于菌體生長。筆者研究發現，溫度過高或過低都會抑制菌體對鎘離子的吸附，菌體的最佳吸附溫度為30 ℃。

圖3 培養溫度對鎘離子吸附的影響Fig.3 Effect of culture temperature on the adsorption of Cd2+

2.3 pH對鎘離子吸附的影響 從圖4可見，DN-1對鎘離子的吸附率在一定范圍內隨著pH的升高而增大，DN-2在pH小于6時對鎘離子的吸附率呈增大趨勢，當pH大于6時吸附率逐漸下降。菌株DN-1在pH為8時吸附率最大，為89.64%，較pH為6時提高了14.88百分點。DN-2在pH為6時吸附率達89.57%，較最低吸附率提高29.05百分點，當pH增加到8時吸附率迅速下降至61.90%，較最大吸附率下降27.67百分點。由此可知，DN-1在中性及弱堿性條件下對鎘離子的吸附率較高，DN-2在弱酸性條件下吸附率較高，吸附效果較好。可見，pH是影響菌體生長的重要因素，不同微生物對環境的酸堿度適應性有差異，pH過低將抑制菌體生長，阻礙對重金屬的吸附。這與樊霆等[13]對重金屬抗性及富集的研究結果一致。

圖4 pH對鎘離子吸附的影響Fig.4 Effect of pH value on the adsorption of Cd2+

2.4 鎘離子初始濃度對鎘離子吸附的影響 從圖5可見，鎘離子初始濃度為40～160 mg/L時DN-2的吸附率呈緩慢增大趨勢，符合Langmuir單分子層吸附行為[14]。當鎘離子濃度為160 mg/L時，DN-2對鎘離子吸附率最大，達89.57%，之后隨鎘離子濃度的升高呈下降趨勢。這是由于

鎘離子濃度的升高增大了其與菌株吸附位點的碰撞幾率，當鎘離子初始濃度繼續升高時，由于吸附位點數量一定，達到最佳吸附狀態后，吸附能力有所下降。也可能是由于鎘離子初始濃度繼續增加，毒性增強，抑制了菌株的生長代謝甚至導致死亡，致使吸附能力減弱。這一規律與邱云云等[15]嗜麥芽窄食單胞菌對鎘的吸附試驗結果一致。DN-1的吸附率隨鎘離子濃度的升高呈遞減趨勢，當鎘離子濃度為80～200 mg/L時，吸附率明顯低于DN-2。這可能是由于不同菌株表面有不同的重金屬吸附受體，不同的受體吸附重金屬的種類有差異，從而使DN-1、DN-2對鎘離子的吸附效果差異明顯。

圖5 鎘離子初始濃度對鎘離子吸附的影響Fig.5 Effect of initial concentration of heavy metals on the adsorption of Cd2+

2.5 超微形態觀察 透射電鏡觀察菌株DN-1、DN-2吸附鎘離子前后的細胞變化特征，結果如圖6所示。在未經鎘

注：a、b分別為K1處理和經過鎘離子處理的DN-1的透射電鏡照片；c、d分別為K2處理和經過鎘離子處理的DN-2的透射電鏡照片。Note：a，b.Transmission electron microscope photograph of strain DN-1 processed by K1 and Cd2+，respectively; c，d.Transmission electron microscope photograph of strain DN-2 processed by K2 and Cd2+，respectively.圖6 菌株DN-1和DN-2的超微形態觀察Fig.6 Ultrastructural observation of strain DN-1 and DN-2

離子處理的條件下，菌株DN-1細胞表面光滑，胞內充實，細胞表面及胞內無沉淀物質(圖6a)，經鎘離子處理后胞內出現黑色顆粒物，微觀結構發生變化，部分細胞的細胞壁被破壞，導致胞內物質外流(圖6b)。這表明胞內沉淀可能是DN-1吸附鎘離子的重要途徑，一定濃度的鎘離子處理會抑制菌株細胞正常生長，導致破裂或死亡。從圖6c和圖6d可見，DN-2在無鎘離子處理條件下，細胞表面光滑，胞內物質均勻且細胞表面無沉淀物質覆蓋，經鎘離子處理后的菌體細胞呈不規則的凸起或彎曲狀，同時細胞膜與細胞壁明顯分離，細胞內可能發生變性反應。推測鎘離子的一部分被吸附在細胞壁表面，一部分在胞內形成金屬沉淀物，表明DN-2對鎘離子有表面吸附和胞內富集兩種作用，且一定濃度的鎘離子處理會給菌株的細胞帶來損傷，使菌體出現凋亡特征。林曉燕等[16]研究了銅綠假單胞菌吸附鎘的機理，結果表明，鎘處理后的菌體表面粗糙，出現不規則凸起，有大量沉淀物聚集；孫靜等[17]研究表明，地衣芽孢桿菌抗鎘和富集鎘的機制是菌體表面的功能基團、表面分泌物聚集和富集鎘離子，以及將鎘離子運輸到菌體內部進行富集。

3 結論

微生物對重金屬的吸附效果與時間、溫度、pH及重金屬離子的初始濃度有關。不同微生物對鎘離子的吸附存在一定差異，且在不同培養條件下差異明顯。從吸附率隨吸附時間的變化來看，菌株對鎘離子的吸附呈先快后慢的過程，基本符合“吸附+細胞膜傳輸”模型，即菌體對重金屬的吸附分為不依靠細胞代謝直接結合在細胞表面和依靠細胞代謝向細胞內的傳輸過程。溫度與菌株吸附率的變化曲線符合微生物生長條件且與微生物生長的吸熱反應規律具有一致性。菌株DN-1適宜在弱堿性條件下吸附鎘離子，菌株DN-2在弱酸性條件下對鎘離子的吸附效果更好。DN-2在一定濃度范圍內，對鎘離子的吸附率明顯高于DN-1，這可能是由于DN-2耐鎘性強且表面具有對鎘離子吸附性較好的受體，因此DN-2是對鎘離子吸附極具潛力的微生物。參考文獻

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Effect of Different Strains on the Adsorption of Heavy Metal Cadmium

WU You, XU Feng-hua*, ZHANG Yun-qi et al

(College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

[Objective] The aim was to screen out strain with high tolerance to cadium, to provide theoretical basis for remediation technology of heavy metal contaminated microorganism. [Method] With DN-1 and DN-2 as tested strains, under different conditions of culture time, temperature, pH, initial concentration of Cd2+solution, the effect of different strains on the adsorption of Cd2+was studied. [Result] The results showed that under certain experimental conditions, when cultured for three days the adsorption rate of DN-1 and DN-2 to Cd2+was the highest, which were 61.92% and 89.57%, respectively;The optimum adsorption temperature was 30 ℃. The optimum pH of DN-1 and DN-2 was 8 and 6; When the initial concentration of Cd2+was 80-200 mg/L range, DN-2 adsorption rate was significantly higher than that of DN-1. Through the transmission electron microscope observation can found that after Cd2+treatment, the cell surface and intracellular accumulation of sediment compared with untreated strains, the internal structure of cells changed obviously. [Conclusion] DN-1 and DN-2 strains have a certain tolerance to cadmium ions, and the adsorption effect is obvious. Extracellular adsorption and intracellular precipitation may be an important way for the strain to adsorb heavy metals.

Cd2+; Strain; Adsorption rate

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD14B06)；哈爾濱市科技成果轉化項目(2014DB3BN037)。

吳優(1992- )，女，河南南陽人，碩士研究生，研究方向：農業廢棄物無害化處理與肥料化利用。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導師，從事農業微生物研究。

2016-11-14

S 182

A

0517-6611(2016)35-0087-03