線粒體自噬在缺血性卒中的機制研究與展望

關瑞橋，鄒偉，孫曉偉，于學平，張莑，袁夢飛，戴曉紅，滕偉，于薇薇

卒中是人類致殘和致死的主要病因之一。美國心臟協會（American Heart Association，AHA）將卒中分為缺血性卒中、出血性卒中以及短暫性腦缺血3個種類[1]。其中缺血性卒中占每年報道的大多數，比例為85%，其他非創傷性的腦出血占總比例的15%。目前缺血性卒中主要治療藥物仍然是美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）認證的阿替普酶，但是阿替普酶由于必須在癥狀發現開始4.5 h內使用，這種嚴格的使用限制，導致僅有3%～8%的患者得以接受治療[2]。因此，研發新的治療手段，延長卒中治療的時間窗是目前卒中治療亟待解決的問題。

1 經典自噬

自噬是一種通過自噬體—溶酶體途徑調節細胞內物質轉化的一種進化保守過程，其主要作用是維持細胞內環境穩態，迅速適應能量饑餓環境，以維持正常生理機能，并且能夠在一定程度上保證應激條件下生物細胞的存活[3-4]。經典自噬反應中最關鍵的過程是細胞質的一部分分離出來形成一個新的區間，即為“自噬體”。自噬體的形成依賴于一系列的動態膜事件：首先在細胞質內形成一個隔膜小囊（吞噬泡或隔離膜），然后擴張成一個杯型結構，隨后又成為一個封閉結構，最后成為一個雙膜結合結構，成為一個成型的“自噬體”，其內部包含一部分細胞質。這個自噬體隨后與溶酶體相融合，其內膜與內容物被溶酶體水解酶分解。最后自噬體溶酶體成為一個殘余體，被分解的物質，例如氨基酸被運送回細胞質內，作為物質原料或能量來源被重新利用[5]。

2 線粒體自噬與卒中

雖然經典自噬通常被認為是一種非特異性自噬，但是有證據表明，一些細胞器例如線粒體和過氧化物酶體更容易被識別并發生自噬反應，這種過程稱為線粒體自噬和過氧化物酶體吞噬[6]。其中線粒體自噬是一種目前被廣泛研究的選擇性自噬，其主要作用為清除破壞的線粒體以保持線粒體在細胞中的穩態[7]。其過程與經典自噬類似。壞死的線粒體導致的神經功能下降與包括卒中在內的多種疾病相關，其機制包括：①嘌呤受體激發的三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）增加；②超氧化物歧化酶導致的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量增加；③亞甲藍引發的抗氧化防御，在卒中情況下可保護神經元[8]。因此在卒中發生過程當中，調節控制線粒體數量和質量的線粒體自噬過程，可能對治療卒中、延緩細胞死亡、保護神經元有十分關鍵的意義。

3 缺血性卒中過程中影響線粒體自噬的主要因素

3.1 ROS機制 ROS是氧化應激反應中重要信號分子，在卒中病理表現中，例如腦缺血、缺血后再灌注情況下，ROS的相對過量將破壞細胞內環境穩態，導致氧化應激反應以及線粒體功能喪失[9]。氧化應激反應條件下的ROS含量增加，超出細胞在自然情況下的處理ROS的能力時，導致氧化應激以及隨后細胞死亡通路的激活[10]。線粒體自噬負責清除由線粒體產生的ROS，適當的清除線粒體可以減少氧化應激反應。例如WEI等[11]的研究發現，鎘離子（cadmium，Cd）可以誘發腦組織中的ROS過量，在Cd處理的腦組織，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）被破壞，線粒體自噬體生成，PINK1水平增高以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增高，線粒體質量下降，以上指標說明了線粒體自噬反應增加；相反的清除ROS可以恢復MMP，提高線粒體的質量，抑制PINK1表達，抑制Parkin向線粒體的聚集，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，說明ROS與Cd誘發的腦線粒體自噬相關，并且證明了ROS通過調節PINK1/Parkin通路上游，調整Cd誘發的線粒體自噬。

3.2 線粒體通透性改變（mitochondrial permeability transition，MPT）機制 線粒體滲透性轉換孔張開導致一系列破壞性反應，伴隨在短時間內大量釋放ROS和鈣離子[12]。線粒體滲透性轉換孔在病理中的作用被廣泛研究，在卒中缺血再灌注損傷中也較為常見，尤其是在ROS過量或鈣離子超載的情況下。MPT的發生使線粒體內膜滲透性增加可導致電化學梯度消失引起的線粒體去極化[13]，進而導致ATP合酶在逆轉過程中消耗ATP。

在卒中發生后給予迅速地再灌注，與此過程相關的線粒體滲透性轉換，起初由環孢霉素A通過與親環蛋白D結合抑制轉換孔打開使組織梗死顯著降低至65%～90%[14]。并且環孢霉素A還可以通過抑制蛋白質磷酸酶、鈣依賴磷酸酶起到保護作用。MPT在細胞自噬、凋亡以及壞死過程中起重要作用。在低應激條件下，有限程度的MPT僅會增加線粒體自噬作為保護機制的發生，使其清除破壞的線粒體。而在過度應激條件下，將導致凋亡的發生[15]。

4 缺血性卒中相關的經典線粒體自噬通路

目前已知細胞通過幾種機制執行線粒體自噬，包括調節線粒體去極化的PINK1/Parkin途徑，及應激誘發的BNIP3、NIX以及與LC3直接相互作用的分子銜接子FUNDC1，以上機制均能夠促進線粒體自噬的發生。以下分別介紹各通路或蛋白調節線粒體自噬的機制以及各個機制與卒中的病理關系及其研究進展。

4.1 PINK Parkin信號通路的機制與缺血性卒中 Pink1-Parkin通路是線粒體自噬中的典型信號通路之一。帕金森患者大腦中發現有功能喪失的線粒體聚集表現，說明了PINK1和Parkin與線粒體質量控制的關系[16]。Pink1編碼PTEN誘發的蛋白激酶是一種包含線粒體定向序列的氨酸-蘇氨酸激酶，Parkin是一種E3泛素連接酶[17]。

PINK1-Parkin通路在在卒中疾病中的研究較少，可能是因為Parkin最初在帕金森疾病中被發現，但近年來關于該機制在卒中，尤其是缺血性卒中中的研究有所增加，在一定程度上闡明了PINK1-Parkin通路參與卒中疾病腦損傷的過程。例如ZHANG等[18]的實驗結果顯示，Parkin在大鼠短暫性大腦中動脈阻塞模型再灌注后3 h有明顯下調，與“自噬潮”高峰的時間相符，說明以Parkin為標記的線粒體被自噬反應清除。線粒體功能喪失以及氧化應激是卒中神經病理學的主要影響因素。PINK1蛋白的基礎研究證明了它在氧化應激條件下的促細胞成活作用，然而其機制并未明確。SAFARPOUR[19]的實驗探究了PINK1在神經元保護機制中，尤其是在缺血性卒中條件下的作用。研究發現，PINK1的缺乏引發神經元中谷氨酸鹽誘發的神經興奮性中毒反應；PINK1的激酶結構域是PINK1參與神經元保護作用的必要條件，而不是線粒體靶向序列；另外，PINK1或Parkin的缺乏可明顯加重大鼠大腦中動脈阻塞體積。

4.2 NIX/BNIP3調節的線粒體自噬與卒中

BNIP3為一種凋亡前體線粒體蛋白，NIX/Bnip3L是BNIP3同族蛋白，并且有55%的同源氨基酸序列[20]。BNIP3是一種特殊的線粒體死亡誘導蛋白亞種蛋白，與線粒體功能喪失以及包括卒中在內的神經元死亡有密切關系[21]。

SHI等[22-23]的研究表明，大鼠發生卒中的大腦缺血缺氧條件下BNIP3的缺乏可引起線粒體自噬反應程度下降，同時細胞凋亡水平也隨之下降，而非選擇性自噬水平上調。線粒體的BNIP3與自噬體標志蛋白LC3相關，說明BNIP3與NIX相似，都可作為線粒體上的LC3結合受體。但是當BNIP3基因沉默時，NIX表達上調，但上調的NIX在病理條件下并不能補償BNIP3的功能。實驗還說明了，NIX的作用為在正常生理條件下調節基本水平的線粒體自噬，而BNIP3主要引起過度的線粒體自噬，進而導致細胞的死亡。

BNIP3與其他蛋白相關的機制較為復雜而多樣，并且在卒中疾病中可能存在一定的特殊性，例如BNIP3與Mieap蛋白（一種P53誘導蛋白）在ROS依賴的反應過程下的相結合，并且Mamie、BNIP3和NIX的共同表達導致MMP明顯下降，該機制與溶酶體蛋白從細胞質向線粒體基質轉移相關[24]。再例如，EndoG是一個BNIP3激動的自噬性死亡通路的中介蛋白，并且BNIP3在卒中當中導致神經細胞自噬性死亡的過程是非caspase依賴性的[25]。

4.3 FUNDC 1調節的線粒體自噬與卒中

FUNDC1是一種新發現的在哺乳動物細胞缺氧條件下誘發的線粒體銜接子，通過LIR機制與LC3直接結合。在缺氧條件下，作為自噬反應起始前復合物的重要組成——ULK1激酶，向FUNDC1發生磷酸化的線粒體轉移，促進FUNDC1與LC3相互作用進而促進線粒體自噬[26]。

另一項最新研究發現，FUNDC1是一種線粒體結合的膜蛋白，在缺氧條件下，FUNDC1通過與ER上的CANX蛋白相互作用而在膜上富集。在線粒體自噬過程中，FUNDC1與CANX分離，并且招募DNM1L/DRP1導致缺氧應激條件下的線粒體分裂[27]。但是目前關于FUNDC1在卒中病理中的研究仍未見報道。

5 線粒體自噬在缺血性卒中的兩面性

目前已知，基礎水平的線粒體自噬是在正常生理情況下控制線粒體質量的必要反應，那么它在缺血性卒中中起到什么樣的作用？是有利的，還是有害的？這個問題在開始就有一定的爭議性，至今這個問題仍然是討論的熱點。例如有研究結果提出，過度的線粒體自噬可導致加速浦肯野細胞死亡[28-29]。因此，線粒體自噬是一把雙刃劍，當輕度病理應激條件下，作為一種保護機制；而在嚴重病理應激條件下，例如缺血性卒中，是一種導致細胞死亡的有害機制[30]。另外自噬反應在腦缺血和缺血后再灌注階段可能有不同作用，例如，ZHANG等[31]的研究發現與永久性腦缺血相反，在再灌注階段用3-MA抑制自噬，加重了而不是減輕了I-R誘發的細胞損傷，并且得出結論在再灌注階段自噬作用的保護作用可能通過線粒體自噬以及對凋亡下游的抑制實現。因此可以推測調整過度表達的線粒體自噬途徑，控制線粒體自噬和凋亡過程或許可以成為延緩細胞死亡過程的一個潛在機制，可以為今后研制卒中的有效治療手段提供有利依據。

6 問題與展望

從線粒體自噬方面探究缺血性卒中能更好地理解其病理機制，近年來對于線粒體自噬的分子調節方面的研究有了很大的進展，但是仍有很多問題等待在以后的研究中被解決，例如線粒體自噬在缺血性卒中的不同階段各有怎樣的作用，其機制如何；以及如何利用線粒體自噬達到臨床治療的目的。以上問題在未來的研究當中仍需要進一步探究。另外，尋找在線粒體自噬方面的神經保護制劑是減少卒中導致的死亡和殘疾的關鍵，例如在最近的研究中LIN等[32]發現，在創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）模型中，褪黑素可通過mtor通路激發線粒體自噬的發生，進而減輕由TBI引發的炎癥反應。褪黑素治療可明顯減少神經元死亡，減輕TBI發生后的神經功能缺損癥狀。在今年最新發表的研究中，SHEN等[33]發現在大鼠大腦中動脈阻塞后，酸性處理誘發的PARK2依賴的線粒體自噬對局灶性腦缺血以及時間窗的延長作用，可將再灌注時間窗從2 h延長至4 h；而PARK2的外源性表達可將時間窗延長至6 h。

對于上述問題的解答不僅可以明確卒中和線粒體自噬之間的關系，并且能為人類發現治療卒中的有效方案提供有力依據。

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