環狀RNA在胰腺癌中的研究進展

彭立嗣 黃浩杰 王凱旋 李兆申

·綜述與講座·

環狀RNA在胰腺癌中的研究進展

彭立嗣 黃浩杰 王凱旋 李兆申

環狀RNA(circularRNA，circRNA)是一類參與轉錄和轉錄后基因表達調節的非編碼RNA(noncodingRNA，ncRNA)[1]，與微小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(1ong non-coding RNA，lncRNA)一起構成了競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)家族，是RNA研究領域的熱點。近年來多種circRNA被證實與胰腺癌的發生及發展有關，本文就circRNA與胰腺癌關系的研究進展作一綜述。

一、circRNA的分類及特征

circRNA由前體mRNA(precursor messenger RNA，pre-mRNA)反向剪接而成，其形成過程可分為外顯子環化(exon circularization)和內含子環化(intron circularization)兩大機制。根據Jeck等[2]提出的模型，外顯子來源的circRNA(exonic circRNA，ecircRNA)有兩種形成方式：(1)套索驅動環化(1ariat-driven circularization)，即外顯子的3′剪接供體(splice donor)與5′剪接受體(splice receptor)共價結合形成套索，套索進行內部拼接后剪除內含子形成circRNA；(2)內含子配對驅動環化(intron-pairing-driven circularization)，即兩個內含子的堿基互補配對形成環形結構，然后切除內含子形成circRNA[2]。Zhang等[3]則提出內含子本身可以環化，形成內含子來源的circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)。最新研究發現，某些環化外顯子中間保留有內含子，此類circRNA被稱為外顯子-內含子circRNA ( exon-intron circRNA or EIciRNA)[4]。

circRNA具有以下生物學特征：(1)與線性RNA不同，circRNA形成封閉的共價環狀結構，沒有游離的ploy A末端，因此不易被RNA核酸外切酶降解，比線性RNA更穩定[2,5]；(2)與線性信使RNA(messenger RNA, mRNA)相比，circRNA更為豐富，種類繁多，如人的成纖維細胞中存在超過25 000種circRNA，為線性mRNA的l0倍[2]；(3)circRNA以外顯子來源為主，大量存在于真核細胞的胞質中，但少數來源于內含子或內含子片段的circRNA則存在于胞核內，且序列高度保守，具有不同組織及不同發育階段表達的時空特異性[2-3]；(4)絕大部分circRNA是ncRNA[2]，具有生物進化保守性；(5)多數circRNA能在轉錄或轉錄后水平發揮調控作用[3]。

二、circRNA與腫瘤的關系

circRNA除在動脈粥樣硬化、帕金森病、阿爾茨海默癥、糖尿病、骨關節炎等疾病的發生和發展中扮演重要角色外，在腫瘤的發生中也發揮生物學功能[6]。

1．circRNA充當miRNA海綿： miRNA是內源性的翻譯抑制因子，可以與靶mRNA的3′端非翻譯區的堿基互補配對結合，切割或降解mRNA，最終誘導目的基因沉默，使相應的功能蛋白表達受到影響[7]。miRNA這種在轉錄后基因表達中的重要作用被證實與多種疾病，特別是腫瘤相關[8]。 而胞質中ecircRNA具有miRNA應答原件(microRNA response element，MRE)，可以通過MRE與miRNA結合，競爭性抑制miRNA的活性，發揮“miRNA海綿(miRNA sponge)”或競爭性內源RNA(ceRNA)的功能，進而解除miRNA對其腫瘤靶基因的抑制作用，在轉錄后水平上上調腫瘤靶基因的表達[1]。其中最有代表性的是小腦變性相關蛋白1反義轉錄物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein l transcript, CDR1as)和cir-SRY。CDR1as是CDR1基因的環狀天然反義轉錄物，含有超過70個miR-7的MRE，是miR-7的環狀抑制劑[9]，因此也被命名為ciRS-7(circular RNA sponge for miR-7)，即充當“miR-7海綿”的circRNA[1]。 ciRS-7結合miR-7，導致miR-7活性降低，使miR-7靶向轉錄物水平增加。此前已多次報道，miR-7作為抑癌因子參與多種腫瘤的信號轉導，包括胃癌[10]、肝癌[11]、子宮頸癌[12]、肺癌[13]、乳腺癌[14]和舌癌[15]等。SRY即Y染色體性別決定區(sex-determining region Y)，其基因外顯子在成年睪丸細胞質中可直接轉錄為cireRNA分子，形成cir-SRY。cir-SRY具有16個miR-138的MRE，作為“miR-138海綿”抑制miR-138的活性[1]，與膽管癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌以及淋巴細胞白血病相關的幾種轉錄物相互作用，影響這些腫瘤的侵襲和轉移[16]。此外，cir-ITCH還通過“海綿化”miR-7、miR-17和miR-214在食管鱗狀細胞癌[17]和結腸癌[18]中發揮抗腫瘤功能；hsa_circRNA_001569作為“miR-145海綿”，抑制miR-145活性從而上調miR-145的靶基因(E2F5、BAG4 FMNL2等)轉錄物，提高其mRNA的蛋白表達水平，促進結腸癌的增殖和侵襲[19]。

2．circRNA充當RNA結合蛋白海綿：circRNA可“海綿化”或螯合RNA結合蛋白(RNA-binding protein，RBP)調控相關蛋白質的活性。最近研究表明，circRNA可以穩定地與阿格蛋白(argonaute，AGO)、RNA聚合酶Ⅱ、Moscleblind(MBL)蛋白、Quaking(QKI)RNA結合蛋白、EIF4A3和其他潛在的RBP關聯，其中一些circRNA是對于特定RBP具有特別高密度結合位點的“超海綿(super-sponges)”，如hsa_circ_0024707可以作為具有85個預測位置的AGO2的超海綿，hsa_circ_0000020包含多種RBP的結合位點，如HuR(6個位點)和FMRP(10個位點)。這些circRNA可作為載體來儲存、分選或呈遞RBP到特定的亞細胞位置，并且可能通過作為競爭元件來調節RBP的功能。而RBP可以參與多種轉錄后調節過程，例如RNA選擇性剪接、轉錄和翻譯，影響細胞增殖、分化、衰老、凋亡以及對氧化應激的細胞應答，在癌癥發展中發揮關鍵作用[6]。

3．circRNA充當轉錄調節因子：circRNA可與靶基因轉錄產生的mRNA的部分堿基直接互補配對，影響mRNA的表達，發揮轉錄調節作用，如CDR1as能與CDR1 mRNA互補配對，增強CDR1 mRNA的穩定性[20]。許多內含子來源的circRNA如ci-ankrd52、ci-mcm5和ci-sirt7可以分別增強與腫瘤發生相關的親本基因ankrd52、mcm5和sirt7 mRNA的表達，從而發揮腫瘤抑制基因或啟動子的作用[6]。

三、circRNA與胰腺癌的關系

circRNA與胰腺癌的關系是目前研究的新興熱點之一。Qu等[21]對比分析了circRNA在胰腺導管腺癌(PDAC)和正常胰腺組織中的微陣列表達譜。結果表明PDAC的一些circRNA表達與正常胰腺組織不同，異常表達主要有以下幾種：

1．ciRS-7：ciRS-7具有miR-7海綿樣吸附作用可抑制miR-7表達，進而升高miR-7靶基因EGFR的水平，30%～50%的胰腺癌組織過表達EGFR蛋白，其過表達水平與胰腺癌患者腫瘤大小、臨床分期及預后呈負相關[22]。Duex等[23]證實，使用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)敲除泛素特異性蛋白酶18基因(ubiquitin-specific protease 18，USP18)Ⅰ型干擾素誘導基因可以上調miR-7表達，使多種癌細胞系中的EGFR蛋白水平降低50%～90%。miR-7通過抑制EGFR mRNA和蛋白的表達及其下游分子ERK1/2和Akt的活性，參與抑制多種腫瘤細胞的生長[24]；而ciRS-7可減弱miR-7這種抑癌作用，且由于ciRS-7的穩定性，因此ciRS-7/miR-7有可能是治療胰腺癌的一個潛在治療靶點。

2．ci-sirt7：翻譯后修飾在細胞中有重要作用，如DNA識別、蛋白-蛋白相互作用、催化活性和蛋白質穩定性。蛋白去乙?；瘜儆诮M蛋白共價修飾，主要由組蛋白去乙?；?histone deacetvlase，HDAC)催化。HDAC共有4類，Sirtuin屬于Ⅲ類HDAC，與酵母沉默信息調節因子2(silent information regulator 2，Sir2)同源[25]。Sirtuin家族里共有7種成員，包括SIRT1～SIRT7，參與調節細胞衰老、應激和代謝過程[26]。Sirtuin在胰腺癌中作用機制的相關研究較少，大多數集中在SIRT1。Zhao等[27]證實，SIRT1基因敲除后胰腺癌細胞增殖和侵襲減弱而凋亡增加。Wauters等[28]報道，抑制SIRT1表達可以預防胰腺腺泡與導管的組織轉化，并減少胰腺導管腺癌腫瘤細胞活力。而McGlynn等[29]研究表明，與SIRT1相反，在PDAC中SIRT7以抗增殖的方式起作用，其低表達與PDAC的強侵襲性和較差的預后相關，而SIRT7在核仁中的高表達與生存期延長、復發間隔時間增加的相關數據和SIRT7的腫瘤抑制作用是一致的。Zhang等[3]設計了多種反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASO)敲除ci-sirt7，并排除了ASO直接作用于SIRT7 pre-mRNA的影響，結果發現SIRT7 mRNA的表達下調，證明ci-sirt7對其親本基因有順式調控作用。其可能機制為ci-sirt7大部分定位于轉錄位點附近，可以與RNA聚合酶Ⅱ復合體(RNA Pol Ⅱ)結合，影響其延長，是pol Ⅱ的正調節因子，促進RNA Pol Ⅱ對SIRT7基因的轉錄。

四、展望

circRNA可以調節胰腺癌的發生，在正常組織與腫瘤組織中具有表達特異性，同時比線性RNA更穩定，具有更長的半衰期，而且在血清中大量富集[30]，這些特點使得circRNA作為胰腺癌的生物標志物及治療靶點的潛力巨大。相信隨著對circRNA研究的不斷深入，會有越來越多與胰腺癌相關的circRNA被發現。雖然目前對circRNA在胰腺癌中發揮的生物學功能和具體作用機制并不十分明確，但可以從特定circRNA與miRNA的相互作用、對其靶基因的反饋作用、以及對所對應的生理病理過程相關指標的影響(如細胞周期、增殖、凋亡、遷移性改變及上皮-間質樣轉變)等多視角著手，并以此為基礎探討circRNA在胰腺癌早期診斷和靶向治療的臨床應用價值將是今后研究努力的方向。

[1] Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013,495(7441):384-388.DOI: 10.1038/nature11993.

[2] Jeck WR, Sorrentino JA, Wang K, et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats[J]. RNA, 2013,19(2):141-157.DOI:10.1261/rna.035667.112.

[3] Zhang Y, Zhang XO, Chen T, et al. Circular intronic long noncoding RNAs[J]. Mol Cell, 2013,51(6):792-806.DOI: 10.1016/j.molcel.2013.08.017.

[4] Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus[J]. Nat Struct Mol Biol, 2015,22(3):256-264.DOI: 10.1038/nsmb.2959.

[5] Jeck WR, Sharpless NE. Detecting and characterizing circular RNAs[J]. Nat Biotechnol, 2014,32(5):453-461.DOI: 10.1038/nbt.2890.

[6] Wang F, Nazarali AJ, Ji S. Circular RNAs as potential biomarkers for cancer diagnosis and therapy[J]. Am J Cancer Res, 2016,6(6):1167-1176.

[7] Preall JB, Sontheimer EJ. RNAi: RISC gets loaded[J]. Cell, 2005,123(4):543-545.

[8] Romero-Cordoba SL, Salido-Guadarrama I, Rodriguez-Dorantes M, et al. miRNA biogenesis: biological impact in the development of cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2014,15(11):1444-1455.DOI: 10.4161/15384047.2014.955442.

[9] Hansen TB, Kjems J, Damgaard CK. Circular RNA and miR-7 in cancer[J]. Cancer Res, 2013,73(18):5609-5612.DOI: 10.1158/0008-5472.

[10] Kong D, Piao YS, Yamashita S, et al. Inflammation-induced repression of tumor suppressor miR-7 in gastric tumor cells[J]. Oncogene, 2012,31(35):3949-3960.DOI: 10.1038/onc.2011.558.

[11] Fang Y, Xue JL, Shen Q, et al. MicroRNA-7 inhibits tumor growth and metastasis by targeting the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2012,55(6):1852-1862.DOI: 10.1002/hep.25576.

[12] Hao Z, Yang J, Wang C, et al. MicroRNA-7 inhibits metastasis and invasion through targeting focal adhesion kinase in cervical cancer[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(1):480-487.

[13] Li J, Zheng Y, Sun G, et al. Restoration of miR-7 expression suppresses the growth of Lewis lung cancer cells by modulating epidermal growth factor receptor signaling[J]. Oncol Rep, 2014,32(6):2511-2516.DOI: 10.3892/or.2014.3519.

[14] Zhang H, Cai K, Wang J, et al. MiR-7, inhibited indirectly by lincRNA HOTAIR, directly inhibits SETDB1 and reverses the EMT of breast cancer stem cells by downregulating the STAT3 pathway[J]. Stem Cells, 2014,32(11):2858-2868. DOI: 10.1002/stem.1795.

[15] Jiang L, Liu X, Chen Z, et al. MicroRNA-7 targets IGF1R (insulin-like growth factor 1 receptor) in tongue squamous cell carcinoma cells[J]. Biochem J, 2010,432(1):199-207. DOI: 10.1042/BJ20100859.

[16] Zhao ZJ, Shen J. Circular RNA participates in the carcinogenesis and the malignant behavior of cancer[J]. RNA Biol, 2015:1-8.

[17] Li F, Zhang L, Li W, et al. Circular RNA ITCH has inhibitory effect on ESCC by suppressing the Wnt/beta-catenin pathway[J]. Oncotarget, 2015,6(8):6001-6013.

[18] Huang G, Zhu H, Shi Y, et al. cir-ITCH plays an inhibitory role in colorectal cancer by regulating the Wnt/β-Catenin pathway[J]. Plos One, 2015,10(6):e131225.DOI: 10.1371/journal.pone.0131225.

[19] Xie H, Ren X, Xin S, et al. Emerging roles of circRNA_001569 targeting miR-145 in the proliferation and invasion of colorectal cancer[J]. Oncotarget, 2016,7(18):26680-26691.DOI: 10.18632/oncotarget.8589.

[20] Hansen TB, Wiklund ED, Bramsen JB, et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA[J]. EMBO J, 2011,30(21):4414-4422. DOI: 10.1038/emboj.2011.359.

[21] Qu S, Song W, Yang X, et al. Microarray expression profile of circular RNAs in human pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Genom Data, 2015,5:385-387.DOI: 10.1016/j.gdata.2015.07.017.

[22] 丁方謎, 蔣金玲, 張俊. 表皮生長因子受體通路阻斷在胰腺癌治療中的進展[J]. 內科理論與實踐, 2015,10(5):384-388.

[23] Duex JE, Comeau L, Sorkin A, et al. Usp18 regulates epidermal growth factor(EGF) receptor expression and cancer cell survival via microRNA-7[J]. J Biol Chem, 2011,286(28):25377-25386.DOI: 10.1074/jbc.M111.222760.

[24] Webster RJ, Giles KM, Price KJ, et al. Regulation of eidermal gowth fctor rceptor sgnaling in hman cncer clls by mcroRNA-7[J]. J Biol Chem, 2009,284(9):5731-5741.DOI: 10.1074/jbc.M804280200.

[25] 戚欣欣, 孫莉. Sirtuin家族及其生物學特性[J]. 華夏醫學, 2016,29(1):169-174.DOI:10.19296/j.cnki.1008-2409.2016-01-060.

[26] Saunders LR, Verdin E. Sirtuins: critical regulators at the crossroads between cancer and aging[J]. Oncogene, 2007,26(37):5489-5504.

[27] Zhao G, Cui J, Zhang JG, et al. SIRT1 RNAi knockdown induces apoptosis and senescence, inhibits invasion and enhances chemosensitivity in pancreatic cancer cells[J]. Gene Ther, 2011,18(9):920-928.

[28] Wauters E, Sanchez-Arevalo Lobo VJ, Pinho AV, et al. Sirtuin-1 rgulates ainar-to-dctal mtaplasia and spports cncer cll vability in pncreatic cncer[J]. Cancer Res, 2013,73(7):2357-2367.DOI: 10.1158/0008-5472.

[29] McGlynn LM, McCluney S, Jamieson NB, et al. SIRT3 & SIRT7: potential novel biomarkers for determining outcome in pancreatic cancer patients[J]. Plos One, 2015,10(6):e131344.

[30] Abu N, Jamal R. Circular RNAs as promising biomarkers: A mini-review[J]. Front Physiol, 2016,7:355.DOI: 10.3389/fphys.2016.00355.

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.02.014

國家自然科學基金面上項目(81372482)；上海市自然科學基金(138R1409300)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化科

王凱旋，Email: wangkaixuan224007@sina.com

2017-02-13)