金柴膠囊微生物限度檢查方法的建立和驗證

郝 福 胡向青 李 東 張 綱 丁 銳 周長明 李志剛*

（1 神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430；2 北京市藥品檢驗所，北京 100035）

金柴膠囊微生物限度檢查方法的建立和驗證

郝 福1胡向青1李 東1張 綱1丁 銳2周長明2李志剛1*

（1 神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430；2 北京市藥品檢驗所，北京 100035）

目的 建立金柴膠囊微生物限度檢查的方法并驗證。方法 按照《中國藥典》2015年版要求，采用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌、黑曲霉和大腸埃希菌進行微生物限度檢查方法驗證。結果 金柴膠囊對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌有較強的抑菌作用，增加稀釋液（1∶50）后，明顯消除了抑菌性；常規(guī)法下檢查霉菌和酵母菌，回收比值均在0.5～2.0；控制菌方法適用性試驗中試驗組均檢出試驗菌。結論 采用平皿法通過增加供試品稀釋液法檢查需氧菌數(shù)；采用常規(guī)平皿法檢查霉菌、酵母菌計數(shù)；控制菌檢查可采用常規(guī)法。所建立的方法適用于金柴膠囊的質量控制。

金柴膠囊；驗證；微生物限度檢查法；稀釋法

金柴膠囊是由中國中醫(yī)科學院中藥研究所和神威藥業(yè)集團聯(lián)合研制的中藥6類新藥，由金銀花、連翹、柴胡、黃芩、半夏、西洋參、綿馬貫眾7味中藥組成，具有透邪解毒之功能，用于治療病毒性上呼吸道感染（中醫(yī)分型屬風熱感冒）[1-3]。對口服固體制劑進行微生物限度檢查是保證藥品安全的一項重要檢測內容。文獻[4-7]報道，金銀花、黃芩、連翹等藥材具有抑菌和殺菌作用。對具有抑菌作用的藥物制劑進行微生物限度檢查時，須采用適宜的方法消除抑菌性才能保證檢測結果的準確性。與《中國藥典》2010年版相比，2015年版藥典在微生物限度章節(jié)部分有較多修訂，體現(xiàn)在培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和檢驗方法等方面。目前尚未見報道金柴膠囊中微生物限度的研究。本文參考《中國藥典》2015年版[8]四部（通則1105和1106）的要求，建立了金柴膠囊微生物限度檢查法并進行了驗證，能客觀地反映藥物中微生物的污染狀況，達到有效、可控的檢測目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器：VS-1300L-U凈化工作臺（蘇州凈化設備公司），XG1. DMX-0.36脈動真空滅菌柜（山東新華醫(yī)療器械廠），LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司），GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司），101-2SA電熱鼓風干燥箱（上海滬南科學儀器聯(lián)營廠），BHC-1300Ⅱ生物安全柜（蘇州凈化設備公司）等。

1.2 菌種：金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]，銅綠假單胞菌

[CMCC（B）10 104]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]，黑曲霉菌[CMCC（F）98 003]，白色念珠菌[CMCC(F)98 001]與大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號20150618）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號20150914）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號20150910）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號20150921）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號20150920）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號20150912）均購自北京三藥科技開發(fā)公司。培養(yǎng)基適用性檢查均符合規(guī)定。

1.4 樣品：金柴膠囊，神威藥業(yè)集團有限公司生產，批號為150901、150902、151003。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌：取新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h；取此培養(yǎng)液1 mL，加入0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，以10倍遞增稀釋至濃度為10-3～10-5的菌懸液。白色念珠菌：取新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，置20～25 ℃培養(yǎng)2～3 d；培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成濃度為10-3～10-5的菌懸液。

黑曲霉：取新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d，加入含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液3～5 mL洗下孢子。然后用管口有紗布的無菌吸管吸出孢子液置無菌試管內，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法稀釋至濃度為10-2～10-4。孢子懸液。

2.2 供試液制備：取本品內容物10 g，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，置45 ℃水浴振搖，混合均勻，靜置10 min，取上清液，制成1∶10供試液，備用。為篩選有效的消除抑菌活性的方法，另將1∶10供試液用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成1∶20和1∶50的供試液。

表1 需氧菌總數(shù)回收比值試驗結果

2.3 需氧菌總數(shù)：分別取1∶10或1∶20或1∶50供試液10 mL置無菌試管中，加入相應試驗菌0.1 mL使其最終濃度為每1 mL不大于100 cfu菌液，混勻，從試管中吸取1 mL注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂，待凝，在30～35 ℃培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿，測定試驗組菌落數(shù)，同法測定菌液組和供試品對照組的菌落數(shù)。計算各菌株回收比值，回收比值=（試驗組的平均菌落數(shù)－供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液對照組的平均菌落數(shù)，結果見表1。

結果表明，用常規(guī)方法進行本品的需氧菌計數(shù)檢查時，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的回收比值均＜0.5，故常規(guī)法不適宜本品的需氧菌計數(shù)檢查。改用增加稀釋液（1∶50）進行驗證，上述5種需氧菌的回收比值均在0.5～2.0。

2.4 霉菌和酵母菌總數(shù)：取1∶10供試液10 mL于滅菌試管中，加入相應試驗菌0.1 mL使其最終濃度為每1 mL不大于100 cfu菌液，混勻，從試管中吸取1 mL注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂，待凝，在20～25 ℃培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿，測定試驗組菌落數(shù)，同法測定菌液組和供試品對照組的菌落數(shù)。計算各菌株回收比值，回收比值=（試驗組的平均菌落數(shù)－供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液對照組的平均菌落數(shù)，結果見表2。

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)回收比值試驗結果

結果表明，本品對霉菌和酵母菌的回收比值均在0.5～2.0，即可確認該供試液在該檢驗條件下無抑菌作用，可采用平皿法進行供試品的霉菌和酵母菌數(shù)檢驗。

2.5 控制菌檢查：按《中國藥典》2015年版四部通則1106控制菌檢查法進行方法驗證。取100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，分別加入1∶10供試液10 mL和制備好的大腸埃希菌懸液1 mL，混勻，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h。取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44 ℃培養(yǎng)24～48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35 ℃培養(yǎng)18～72 h。結果，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上均檢出了試驗菌，表明常規(guī)法適宜檢查供試品的大腸埃希菌。

2.6 樣品檢測：取樣品，按照“2.2”項下方法制備供試液，采用已驗證的微生物限度檢查方法進行檢驗，結果均未檢出大腸埃希菌，需氧菌、霉菌和酵母菌符合限度要求，合格率為100.0%。

3 討 論

本品原依照《中國藥典》2010年版微生物限度方法采用離心沉淀法來消除抑菌性，但離心沉淀法可能鑒于方法回收率重現(xiàn)性較差且一般無法保證細菌的回收率等原因未被2015版藥典收載[9]。2015版藥典收錄的去除供試品抑菌作用的方法有：增加稀釋液或培養(yǎng)基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑、采用薄膜過濾法或上述幾種方法的聯(lián)合使用[8]，因此我們重新依照要求配制了不同稀釋級別的供試液開展驗證，結果表明，供試品對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等試驗菌株有較強的抑菌作用，通過增加稀釋液法（1∶50）進行需氧菌計數(shù)驗證，結果各規(guī)定菌株的回收比值達到藥典要求。本方法準確、可靠，可用于金柴膠囊的質量控制。

與《中國藥典》2010版相比，2015版藥典中微生物限度檢查進行了較大的修訂[10-11]微生物計數(shù)改為需氧菌總數(shù)和酵母總數(shù)，培養(yǎng)基更改為廣譜性的胰酪大豆瓊脂和沙氏葡萄糖瓊脂，對回收試驗等內容和要求也進行了對應的修訂，方法更傾向于與國際接軌。本文均按照2015版藥典中相關要求，開展研究與驗證，對該類藥物微生物限度檢查方法制定有一定參考和借鑒意義。

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Establishment and Validation of a Microbial Limit Test Method for Jinchai Capsules

HAO Fu1, HU Xiang-qing1, LI Dong1, ZHANG Gang1, DINGRui2, ZHOU Chang-ming2, LI Zhi-gang1
(1 Shineway Pharmaceutical Group Co., Ltd, Shijiazhuang 051430, China; 2 Beijing Institute for Drug Control, Beijing 100035, China)

ObjectiveTo establish and validate a method of microbial limit test for Jinchai capsules.MethodsThe microbial limit test method was validated using Staphylcoccus aureu, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Candida albicansand Escherichia coli according to Chinese Pharmacopoeia Edition 2015.ResultsJinchai capsules have a strong inhibition on Staphylcoccus aureu, Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis. The antibacterial activity of the samples was eliminated after diluting the sample 1mL to 50mL. The recovery ratios for counts of mold and yeasts were all within 0.5-2.0 when using the routine plate count method, and the validation result of control bacteria was positive.ConclusionMedium dilution method can be used for total aerobic microbial count. The routine method can be used with enumeration mold and yeasts. Specifed microorganisms can be tested when general method was applied. The method is effective and can be used to the quality control of the Jinchai capsules.

Jinchai capsules; Validation; Microbial limit test; Medium dilution method

R282.710.3

B

1671-8194（2016）35-0001-02

石家莊市重大科技計劃項目（151200257A）

*通訊作者