超濾法去除森林腦炎滅活疫苗原液細菌內毒素的效果分析

費 剛

（長春生物制品研究所，吉林 長春 130062 ）

超濾法去除森林腦炎滅活疫苗原液細菌內毒素的效果分析

費 剛

（長春生物制品研究所，吉林 長春 130062 ）

目的 利用超濾法去除森林腦炎滅活疫苗原液細菌內毒素。方法 采用截留相對分子質量30萬的超濾膜對森林腦炎滅活疫苗原液進行超濾，用動態濁度法檢測超濾前后森林腦炎滅活疫苗原液中細菌內毒素含量。結果 利用超濾法去除森林腦炎滅活疫苗原液在生產過程中產生的細菌內毒素，將細菌內毒素的清除效果進行定量分析，細菌內毒素去除率可達80.0%～94.0%。結論 采用截留相對分子質量30萬的超濾膜對森林腦炎滅活疫苗原液超濾中進行細菌內毒素的清除方法效果理想。

森林腦炎疫苗；細菌內毒素；超濾法；動態濁度法

森林腦炎是由森林硬蜱傳染的一種疾病，疾病主要分布在我國東北地區的森林地帶，由硬蜱叮咬而感染森林腦炎病毒導致患病，稱森林腦炎病[1]。森林腦炎滅活疫苗可以預防森林腦炎疾病，在森林腦炎滅活疫苗生產過程中利用超濾技術可以有效去除細菌內毒素。細菌內毒素是人體在醫療診治過程中產生發熱現象的物質，極微量內毒素就能引起體溫上升、休克甚至死亡[2]。2010年版《中國藥典（第三部）》記載森林腦炎滅活疫苗細菌內毒素應不高于100 EU/mL（附錄XIIE凝膠限度試驗）[3]。動態濁度法可以定量測定細菌內毒素，測定范圍在0.006～300 EU/mL。此法操作簡單、快速、靈敏度高、檢測范圍寬，但需要精密的專用儀器[4]。本人利用超濾法去除森林腦炎滅活疫苗原液超濾前后的細菌內毒素含量的變化，定性定量地檢測，系統地分析超濾技術除去細菌內毒素的效果。

1 實驗材料與試藥

1.1 超濾設備：①超濾器廠家 Millipore 規格/型號CUF50；②細菌內毒素檢測儀（BET-16M型）（天津天大天發科技有限公司）。

1.2 森林腦炎疫苗原液：生產批號 20110605、20110806、20111009（長春生物制品研究所提供）。

1.3 試劑：①細菌內毒素工作標準品（中國生物制品檢定所規格150 EU/Amp 批號2012-6）；②動態濁度法鱟試劑（ λ=0.03 EU/mL規格0.6 mL/Amp 批號0121201）；③細菌內毒素檢查用水（規格5 mL/Amp 批號0120102）；④細菌內毒素指示劑（規格300 mL/Amp批號0120214）。試劑提供單位：湛江博康海洋生物有限公司。

2 方法與結果

2.1 用動態濁度法定量測定三批森林腦炎滅活疫苗原液的細菌內毒素含量，結果見表1。

表1 細菌內毒素去除效果見

2.2 將上述三批森林腦炎滅活疫苗原液的容器分別與超濾用滅菌的封閉系統相連接。 對疫苗原液進行超濾，所用膜包截留分子量為300 kD，將三批超濾液封閉待檢。

2.3 用動態濁度法定量測定超濾后的三批森林腦炎滅活疫苗的細菌內毒素含量量，結果見表1。

2.4 細菌內毒素的檢測

2.4.1 含量測定：細菌內毒素去除率Q=（C前-C后）/C前×100%，C前和C后分別是藥液超濾前后細菌內毒素的含量 EU/mL[5]。表1中顯示，三批原液經超濾后細菌內毒素大幅降低，去除細菌內毒素效率達到80%～94%，細菌內毒素濃度在7.80～29.22 EU/mL，均在藥典規定細菌內毒素應不高于100 EU/mL。超濾液檢定中效價測定、病毒滴定、無菌檢查、支原體檢查、抗原含量和蛋白含量均在要求范圍之內。

2.4.2 標準曲線的繪制和試驗的可靠性驗證：用細菌內毒素標準品制作標準溶液系列，配制成內毒素濃度分別為2.0 EU/mL、0.5 EU/mL、0.125 EU/mL、0.03125 EU/mL的溶液。將含有0.1 mL鱟試劑溶液的每個反應管內分別加入0.1 mL的2.0 EU/mL、0.5 EU/mL、0.125 EU/mL、0.03125 EU/mL標準溶液，均勻混溶，利用檢測儀檢測，讀取數據。各濃度標準溶液檢測3份，同時作陰性對照（NC ）標準溶液2份，結果見表2。利用統計數據進行系統分析，以最小二乘方法計算，標準曲線數據為：回歸方程logT=3.160-0.321logC，相關系數r=-0.9991，濃度范圍0.03125 EU/mL～2.0 EU/mL。試驗結果，標準溶液濃度的內毒素在2～0.03125 EU/mL時，試驗反應可以控制在3600 s之內，陰性對照符合標準要求，標準曲線溶液0.03125 EU/mL也就是最小濃度反應時間為3400 s小于陰性對照時間，標準曲線試驗可靠。

表2 標準曲線試驗可靠性

2.4.3 干擾實驗與內毒素測定：將三個批號的森林腦炎滅活疫苗超濾液分別稀釋600倍，各稀釋后的液體作為供試液（NPC），將0.5 EU/mL的內毒素標準品溶液，加入到各批號的供試液之中，制作陽性對照（PPC）。將各批號溶液加入0.1 mL鱟試劑溶液，定量檢測細菌內毒素，各濃度要求檢測2份。計算回收率：R=（CPPC-CNPC）/ λm× 100%。式中CPPC ——樣品陽性對照液中細菌內毒素的含量EU/mL。CNPC——超濾后細菌內毒素的含量EU/mL。λm——標準曲線中點或一個靠近中點的細菌內毒素濃度，即0.5 EU/mL[6]。在試驗過程中供試品溶液無干擾的前提是細菌內毒素回收率必須在50%～200%，此試驗的回收率在114.26%～137.40%[7]。此試驗表明供試液在該濃度下對鱟試劑無干擾作用，結果符合規定。

3 討 論

采用截留相對分子質量30萬的超濾膜對森林腦炎滅活疫苗原液進行超濾，去除森林腦炎滅活疫苗原液中細菌內毒素效果可靠，去除率可達到94%，有效成分的透過率在合理范圍之內。超濾方法去除森林腦炎滅活疫苗原液中細菌內毒素效果是安全有效的，可以廣泛應用于生產之中。

[1] 費剛.森林腦炎滅活疫苗穩定性檢定[J].中國實用醫藥,2014,9 (3):272.

[2] 姚偉.生物制品生產中內毒素的控制及去除[C].2010.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)附錄XIE[M].北京:中國醫藥出版社,2010:附錄95.

[4] 汪玲.細菌內毒素的檢測方法及其應用概況[J].中國藥師,2003, 6(5):316-317.

[5] 伊楠.超濾法去除中藥注射液中的細菌內毒素[J].中國醫藥工業雜志,2008,39(12):927-929.

[6] 樓惠琴.超濾技術去除羥基喜樹堿中細菌內毒素的研究[J].廣州化工,2014,42(10):92-94.

[7] 胡翮.動態濁度法測定細辛注射液中細菌內毒素含量[J].中國藥師,2012,15(6):891-892.

R512.34

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1671-8194（2016）35-0019-02