PEG 脅迫條件下水、旱稻種子萌發的生理效應及脂質過氧化作用的影響

河南省種子管理站 滕開瓊 司冰 賈文華

PEG 脅迫條件下水、旱稻種子萌發的生理效應及脂質過氧化作用的影響

河南省種子管理站 滕開瓊 司冰 賈文華

水稻和旱稻是在人工選擇和自然選擇的過程中，根據水分供應狀況分化出來的兩大類型。兩種類型的關鍵差別在于抗旱性方面，旱稻是天然“抗旱類型”，在生長的全生育期可不灌水或者只在嚴重干旱的情況下輔以適量灌溉；水稻是天然“敏旱類型”，水稻整個生育期大部分時間需要在有水的條件下生長。種子萌發是一個復雜的生理過程，涉及到超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性變化，種子萌發也受到植物體內丙二醛（MDA）含量的影響，這些因素共同決定著種子的萌發。在干旱脅迫環境條件下，水稻種子的萌發過程吸水會受到抑制，這樣會導致種子中與碳氮代謝相關酶的活性及其代謝產物受到影響，種子的萌發受到抑制。旱稻需水少，抗旱性強，干旱條件下旱稻種子萌發是否優于水稻，干旱條件下水、旱稻種子萌發的生理基礎是什么？本研究以水稻越富和旱稻IRAT109為材料，通過15% PEG模擬干旱脅迫，研究水、旱稻在干旱脅迫條件下種子萌發的生理效應及脂質過氧化作用，探討干旱脅迫條件下旱稻種子強萌發能力的內在生理基礎，以期為闡明栽培稻種子抗旱萌發出苗提供理論基礎，為旱直播稻的推廣與應用提供實踐依據。

一、材料與方法

（一）試驗材料

以水稻品種越富為背景親本，以旱稻IRAT109為供體親本而得到的BC5F5導入系材料。

（二）試驗方法

種子用10%的H2O2消毒10 min，然后用滅菌蒸餾水將種子沖洗干凈；28 ℃蒸餾水浸種1 d；采用培養皿進行種子萌發試驗，每培養皿放置3張已滅菌濾紙，加入20 mL的15%PEG6000進行干旱模擬處理，蒸餾水為對照（均已滅菌）。均勻點入50粒種子，3個重復，每重復30個培養皿。處理5 d。在光照培養箱內進行，光照強度為200 la，mol/(m·s)，光照/黑暗時間為12 h/ 12 h，光照溫度為28 ℃，黑暗時溫度為25 ℃。分別進行以下項目的測定。

稱取萌發種子（去殼，種子和萌發的根系、芽混合）約0．5 g，于研缽中加入5 mL提取液（50 mmol/L，pH值為7．8磷酸緩沖液，含1% PVP），在冰上研磨至勻漿后，于4 ℃以12 000 rpm離心20 min，上清液用于抗氧化酶SOD和POD活性的測定。

1．SOD活性測定。按下表依次向玻璃試管中加試劑，黑暗及光照下設置的對照均以pH值為7．8磷酸緩沖液代替酶提取液，混勻后將黑暗對照試管放于暗處，其余放置于4 000 LX光下30 min。反應結束后，以黑暗對照為空白，分別測定560 nm處OD值。

SOD總活性=（Ack - Ae）× V/Ack×0．5×W×Vt；

Ack為照光對照管的吸收值；Ae為樣品管吸的收值；V為樣品總體積（mL）；Vt為測定時樣品用量（mL）；W為樣品鮮質量（g）。

2．POD活性的測定。向比色皿中加入POD反應混合液3 mL，然后加入酶提取液1 mL（以磷酸緩沖液作為校零對照），立即于分光光度計470 nm下測定OD值，每30 s計數1次，測定10次。

POD酶活性=[Δ470×V/（W× Vt）] / 0．01；

Δ470為每分鐘底物溶液吸光值的變化；V為樣品總體積(mL)；Vt為測定時樣品用量（mL）；W為樣品鮮質量（g）；以每分鐘內酶活性變化0．01為一個酶活性單位。

3．MDA含量的測定。于15% PEG處理的0 d、1 d、2 d、3 d和5 d，處理與對照每次重復各取15粒種子，于-40 ℃放置以備MDA含量測定。

4．采用硫代巴比妥酸法進行測定。稱取萌發種子（去殼）約0．5 g（當根、芽長達1 cm時去掉根、芽），于研缽中加5 mL 5% TCA冰浴研磨至勻漿，轉移至10 mL離心管中，4 000 rpm離心10 min；取上清液1．5 mL加2．5 mL 5% TBA沸水浴30 min，冰浴冷卻，4 000 rpm離心10 min；上清液于532 nm、600 nm和450 nm下測定OD值。

MDA含量（nmol/g）=[6．452×（OD532- OD600）- 0．559×OD450× V]/(Vt×W)

V為提取液總體積（mL）；Vt為測定時取用的提取液體積（mL）；W為鮮質量（g）。

二、結果與分析

（一）PEG處理對種子萌發過程中SOD和POD活性的影響

植物體在受到不良的外界環境脅迫時會啟動自身的抗氧化還原系統，其中POD和SOD是抗氧化系統中的關鍵酶。POD的作用是負責清除H2O2，從而防止氧化傷害或毒性更強的自由基·OH的形成，而種子中一定含量的H2O2則有利于種子的萌發；SOD的作用是催化過氧陰離子（O2-·）發生歧化反應生成H2O2，清除自由基。正常萌發情況下，水稻越富及導入系IL392種子內的SOD活性變化趨勢基本一致，萌發前期的SOD活性較高，在萌發1～2 d達到最高，分別為133．46U·g-1FW和121．61 U·g-1FW，在第3天開始顯著降低。而IRAT109在浸種1天后萌發0d的SOD活性最高，然后一直呈下降趨勢，第3天也出現明顯的下降趨勢。PEG處理后，SOD活性變化在品種間沒有明顯差異，IRAT109和IL392更早地出現了上升趨勢，在脅迫處理后5 d，SOD活性都基本達到了初始的酶活水平，其中IRAT109最高，達到了131．51 U·g-1FW。由圖1、圖2可知，POD活性變化與SOD趨勢相反，前期處于較低水平，隨著種子萌發進程其活性不斷升高，在正常水分萌發情況下，POD活性一直處于上升狀態，IRAT109和IL392在第3天、第5天顯著高于越富。而PEG脅迫后3個材料的POD活性都在第2天達到最高，之后開始平緩下降，且IRAT109的POD活性高于同時期越富及IL392。這可能是由于前期的SOD產生的H2O2有利于種子的萌發，后期過高的H2O2會產生毒害作用。逐漸升高的POD活性會清除H2O2，以減少對萌發種子的毒害作用 。

圖1 PEG脅迫處理后萌發種子中SOD的活性變化

圖2 PEG脅迫處理后萌發種子中POD的活性變化

圖3 PEG脅迫處理后萌發種子中MDA的含量變化

（二）PEG處理對種子萌發過程中MDA含量的影響

在正常水分萌發情況下，MDA含量總體處于上升趨勢，由于后期SOD活性顯著下降，萌發2天后的種子中MDA含量開始顯著上升（圖3）。PEG脅迫后MDA含量都在第1天最低，之后開始上升。由于受到PEG脅迫，在種子萌發的過程中SOD、POD并不能完全保持細胞內自由基平衡，而且隨著種子的萌發，種子本身就處于消耗降解的過程，所以在SOD和POD活性較高的情況下MDA含量仍較高，這可能是由于測定時去掉了大于1cm的根和芽，萌發過程中的種子處于一種衰老過程，后期SOD活性顯著下降，而POD活性的升高并未降低MDA的含量。

三、結果與討論

種子萌發和幼苗生長狀況是由其內在遺傳因素和外界環境條件共同決定的。水分是各種環境條件中的主要限制因素。水稻和旱稻是研究干旱脅迫種子萌發分子機制很好的材料。水分是植物種子萌發的首要條件。種子吸水后，細胞才會從靜止狀態轉向活躍狀態，然后才能萌發。種子萌發是指種子從吸脹作用開始的一系列有序的生理過程和形態發生過程，在這一期間的各種逆境都會引起種子的生理反應，如膜脂過氧化反應、抗氧化防御反應及各種激素的條件作用。PEG模擬干旱脅迫3個材料的MDA含量總體都明顯上升，顯示遭受水分脅迫。但是旱稻IRAT109比水稻有較高的POD活性，清除MDA和H2O2等危害，以減少對萌發種子的毒害作用。目前，栽培稻旱直播已經成為一種趨勢，為了保證旱直播足夠的成苗率及秧苗生長均勻度，研究水、旱稻在干旱脅迫下種子萌發的生理效應及脂質過氧化反映，以及進一步發現旱脅迫下控制種子萌發的基因調控網絡，有助于我們從生理和基因水平調控種子的萌發，這對于保障我國稻米糧食安全具有重要的意義。