褪黑素對阿爾茨海默病大鼠學習記憶障礙的影響及作用機制

鄧海峰 孫縵利 楊 偉 王興紅 常全忠

(漯河醫學高等專科學校基礎醫學部,河南 漯河 462000)

褪黑素對阿爾茨海默病大鼠學習記憶障礙的影響及作用機制

鄧海峰1孫縵利 楊 偉2王興紅 常全忠

(漯河醫學高等專科學校基礎醫學部,河南 漯河 462000)

目的 探討褪黑素(MT)對阿爾茨海默病(AD)大鼠學習記憶障礙的影響及作用機制。方法 SD大鼠隨機分為3組：正常對照組、東莨菪堿模型組和MT組。正常對照組和模型組每天腹腔注射生理鹽水2 ml；MT組每天腹腔注射MT溶劑(2 mg/kg) 2 ml，連續給藥7 d，于第8天進行Morris水迷宮測試，測試6 d，每天測試前30 min各組(正常對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水)腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg。于第15天開始進行電生理記錄。結果 ①水迷宮測試6 d后，模型組逃避潛伏期的時間(61.86±8.84)s，與正常對照組(11.13±6.08)s相比，縮短趨勢明顯較慢(P<0.01)；MT組逃避潛伏期為(16.250±10.926)s，與正常對照組相比無顯著差異(P>0.05)。水迷宮測試的第6天，模型組大鼠的穿環次數為(1.91±0.87)次，較正常對照組(3.34±0.69)次明顯減少(P<0.01)；MT組大鼠的穿環次數為(3.15±0.72)次，與正常對照組相比無顯著差異(P>0.05)。②給予100 Hz 1 s刺激后，正常對照組誘發反應的幅度為基準值的(156.36±9.69)%，MT組為(142.25±11.03)%，兩組與刺激前相比均有顯著差異(P<0.01)，模型組的幅度為基準值的(108.56±12.41)%，與刺激前相比無顯著差異(P>0.05)；給予100Hz 1 s刺激后，正常對照組誘發反應的斜率為基準值的(137.31±13.74)%，MT組為(130.59±13.65)%，兩組與刺激前相比均有顯著差異(P<0.01)，模型組的斜率為基準值的(101.36±11.72)%，與刺激前相比無顯著性差異(P>0.05)。結論 MT對東莨菪堿所致的大鼠學習記憶障礙有明顯的改善作用，并且可以阻斷東莨菪堿對皮層長時程增強的抑制。

褪黑素；東莨菪堿；學習記憶；皮層；長時程增強

目前阿爾茨海默病(AD)的發病機制還不是很清楚。近年研究發現在老年人和AD病人體內褪黑素(MT)的含量明顯減少〔1〕。外源性注射一定劑量的MT對AD動物模型的學習記憶障礙有一定的改善作用〔2〕，但作用機制還不明確。為進一步明確MT對AD的治療機制，本實驗擬在在體水平采用行為學和電生理學等方法探討MT對東莨菪堿致大鼠學習記憶障礙的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性成年SD大鼠，體重(250±10)g，由南華大學實驗動物中心提供，所有動物都在自然光暗周期的環境中飼養，自由覓食、飲水。動物隨機分為3組(n=8)：正常對照組、東莨菪堿模型組和MT組。正常對照組和模型組每天腹腔注射生理鹽水2 ml；MT組每天腹腔注射MT溶劑(2 mg/kg) 2 ml，連續給藥7 d，于第8天開始造模并進行Morris水迷宮測試，測試6 d。

1.2 造模方法 參照Oh 等〔3〕方法于每天測試前30 min各組(正常對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水)腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg，直到實驗全部結束。

1.3 試劑和儀器 MT、東莨菪堿、烏拉坦均購自Sigma公司，Morris 水迷宮裝置(中國醫學科學院藥物研究所研制)。

1.4 Morris 水迷宮測試 Morris 水迷宮水池中加入適量的墨汁，使水池成為不透明色(去除視覺干擾)。在圓桶的上緣等距離地設東、南、西和北4個標記點，作為大鼠進水池的入水點，以這4個入水點在水面和水桶底部的投影點，將水面和水桶部分均等的分為4個象限。將平臺放置于第三象限的中間。水溫保持在22℃～23℃。大鼠訓練：訓練時，將大鼠面向池壁從四個入水點分別放入水池，記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間，作為潛伏期，大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立60 s。若入水后120 s大鼠未能找到平臺，則將其輕輕從水中拖上平臺，并停留10 s，然后進行下一次訓練。每只大鼠從四個入水點分別放入水池為一次訓練，兩次訓練間隔30 s，用紙巾將大鼠擦干凈。

1.4.1 定位航行試驗 觀察和記錄大鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時間，即記錄其潛伏期，歷時5 d，每天上下午各訓練4次(各個象限)，記錄其潛伏期，上臺后休息60 s，繼續下一個象限訓練。用于測量大鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力。

1.4.2 空間搜索試驗 第6天，在定位航行試驗后去除平臺，從同一個入水點放入水中，測其120 s內穿環次數。用于測量大鼠學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力。

1.5 在體電生理記錄 20%烏拉坦(0.8 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于腦立體定位儀上。記錄電極位置(P：1.9 mm，LR：5.5 mm，H：0.8～0.9 mm)。觸須刺激由電刺激器控制氣泵產生氣流，由玻璃微電極導出，氣流方向由觸須的正下方垂直于觸須，一般引起的觸須振動為-1 mm。當找到對應的主反應觸須(PW)后，記錄單刺激誘發的皮層反應及給予100 Hz 1 s的刺激后該誘發反應的可塑性變化。

1.6 統計學方法 應用SPSS12.0統計軟件包進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 MT對大鼠定位航行試驗的影響 隨著測試的進行，各組大鼠的逃避潛伏期時間均有縮短趨勢：正常對照組從第1天的(97.75±18.06)s 縮短到第6天的(11.13±6.08)s；模型組從第1天的(118.99±13.18)s 縮短到第6天的(61.86±8.84)s；MT組從第1天的(100.13±12.55)s 縮短到第6天 的(16.25±10.93)s。與正常對照組相比，模型組逃避潛伏期的時間縮短趨勢明顯較慢(P<0.01)；而MT組的縮短趨勢雖略慢于正常對照組，但無顯著差異(P>0.05)。這表明東莨菪堿的確可以導致大鼠學習記憶障礙，而MT對東莨菪堿誘導的學習記憶障礙有明顯的改善作用。

2.2 MT對大鼠空間搜索試驗的影響 正常對照組大鼠的穿環次數為(3.34±0.69)次；模型組大鼠的穿環次數為(1.91±0.87)次；MT組大鼠的穿環次數為(3.15±0.72)次。模型組的穿環次數較正常對照組明顯減少(P<0.01)；MT組與正常對照組相比無顯著差異(P>0.05)。表明MT對東莨菪堿誘導的學習記憶障礙有明顯的改善作用。

2.3 MT對大鼠皮層可塑性的影響 正常對照組誘發反應的幅度為基準值的(156.36±9.69)%，MT組為(142.25±11.03)%，兩組與刺激前(100%)相比均有顯著差異(P<0.01)，模型組的幅度為基準值的(108.56±12.41)%，與刺激前相比無顯著差異(P>0.05)；給予100 Hz 1 s刺激后，正常對照組誘發反應的斜率為基準值的(137.31±13.74)%，MT組為(130.59±13.65)%，兩組與刺激前(100%)相比均有顯著差異(P<0.01)，模型組的斜率為基準值的(101.36±11.72)%，與刺激前相比無顯著性差異(100%，P>0.05)。提示正常對照組和MT組可以誘發突觸反應的長時程增強(LTP)，而模型組沒有誘發出LTP。這表明MT可以明顯改善東莨菪堿對大鼠皮層LTP的抑制。

3 討 論

東莨菪堿是M型膽堿能受體的拮抗劑〔4〕，易通過血腦屏障。腹腔注射東莨菪堿可以阻斷中樞乙酰膽堿與其受體的結合，使突觸間隙中過多的乙酰膽堿游離，一定范圍內的乙酰膽堿是神經信號傳遞的基礎，而過多的乙酰膽堿會產生神經毒性，致使膽堿能神經通路異常〔4〕。中樞膽堿能系統在學習、記憶、注意力等認知功能的調節中起關鍵作用，研究表明海馬、皮層以及大腦其他腦區的膽堿能神經通路紊亂會引起學習記憶環路的調節異常〔5〕，導致AD或其他學習記憶障礙疾病的發生。目前，東莨菪堿致學習記憶障礙的動物模型在AD研究中被廣泛運用，本實驗研究結果與之前的報道一致。

MT是松果體分泌的一種吲哚胺類激素，具有高度脂溶性，外周給藥能通過血腦屏障而發揮作用〔6〕。之前對MT的研究主要集中在調節晝夜節律〔7〕、睡眠〔8〕、抗氧化〔9〕、抗癌〔10〕等多項生理功能方面。近年研究發現MT對學習記憶也有一定的調節作用，但尚無定論，有研究認為MT對持續光照或藥物引起的學習記憶障礙有改善作用〔11〕，也有報道MT能阻斷大鼠海馬齒狀回及CA1區的突觸LTP，據此認為MT對學習記憶有抑制作用〔12〕。這些研究結果主要是在離體水平得到的，在在體水平上的研究報道甚少。而在在體情況下，大腦內各結構之間的聯系保持完整，生理環境更穩定，所得到的結果更能反映MT對學習記憶的調節功能。

本結果表明，MT可以明顯改善東莨菪堿誘導的大鼠學習記憶障礙及大鼠內皮層LTP的抑制。其機制可能是：通過血腦屏障的東莨菪堿可以引起中樞乙酰膽堿酯酶(AchE)增多〔13〕，進而引起乙酰膽堿(ACh)水解增多，中樞ACh含量減少，而ACh可提高新生神經元的存活率及抗凋亡，從而對學習記憶施加影響，東莨菪堿導致的ACh減少會造成學習記憶的損傷；MT也可以通過血腦屏障影響膽堿能系統，不過與東莨菪堿的作用相反，MT可以通過增強膽堿乙酰化轉移酶(ChAT)的活性抑制ACh過多的釋放水解〔14〕，進而保護膽堿能神經元，改善東莨菪堿引起的中樞膽堿能系統異常，從而改善記憶環路的異常。

1 Pandi-Perumal SR,Bahammam AS,Brown GM,etal.Melatonin antioxidative defense:therapeutical implications for aging and neurodegenerative processes〔J〕.Neu Res,2013;23(3):267-300.

2 Mehta KD,Mehta AK,Halder S,etal.Protective effect of melatonin on propoxur-induced impairment of memory and oxidative stress in rats〔J〕.Environ Toxicol,2014;29(6):705-13.

3 Oh SR,Kim SJ,Kim DH,etal.Angelica keiskei ameliorates scopolamine-induced memory impairments in mice〔J〕.Biol Pharm Bull,2013;36(1):82-8.

4 Li YS,Hong YF,He J,etal.Effects of magnolol on impairment of learning and memory abilities induced by scopolamine in mice〔J〕.Biol Pharm Bull,2013;36(5)：764-71.

5 Lee B,Sur B,Shim J,etal.Acupuncture stimulation improves scopolamine-induced cognitive impairment via activation of cholinergic system and regulation of BDNF and CREB expressions in rats〔J〕.BMC Compl Altern Med,2014;14(1):338.

6 Senol N,Naziroglu M.Melatonin reduces traumatic brain injury-induced oxidative stress in the cerebral cortex and blood of rats〔J〕.Neurol Regen Res,2014;9(11):1112-6.

7 Mariko Yanagihara,Masaki Nakamura,Akira Usui,etal.The melatonin receptor agonist is effective for free-running type circadian rhythm sleep disorder:case report on two sighted patients〔J〕.Tohoku J Exp Med,2014;234(2):123-8.

8 Wade AG,Farmer M,Harari G,etal.Add-on prolonged-release melatonin for cognitive function and sleep in mild to moderate Alzheimer's disease:a 6-month,randomized,placebo-controlled,multicenter trial〔J〕.Clin Interv Aging,2014;9(7):947-61.

9 Reiter RJ,Tan DX,Fuentes-Broto L.Melatonin:a multitasking molecule〔J〕.Prog Brain Res,2010;181(8):127-51.

10 Jung-Hynes B,Reiter RJ,Ahmad N.Sirtuins,melatonin and circadian rhythms:building a bridge between aging and cancer〔J〕.J Pineal Res,2010;48(1):9-19.

11 Rawashdeh O，Maronde E.The hormonal zeitgeber melatonin:role as a circadian modulator in memory processing〔J〕.Front Mol Neurosci,2012;5(27):1-6.

12 Wang LM,Suthana NA,Chaudhury D,etal.Melatonin inhibits hippocampal long-term potentiation〔J〕.Eur J Neurosci,2005;22(9):2231-7.

13 Hayashi M,Tajima H,Hashimoto Y,etal.Secreted calmodulin-like skin protein ameliorates scopolamine-induced memory impairment〔J〕.Neuroreport,2014;25(9):725-9.

14 Wang JZ,Wang ZF.Role of melatonin in Alzheimer-like neurodegeneration〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2006;27(1):41-9.

〔2015-06-11回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河南省科技廳基礎與前沿技術研究(152300410014)；漯河醫學等專科學校2015年度基礎科學研究項目(2015-S-LMC06)

常全忠(1965-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事神經生理學研究。

鄧海峰(1983-)，男，碩士，講師，主要從事神經生理學研究。

R319

A

1005-9202(2017)02-0286-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.012

1 南華大學醫學院基礎醫學部 2 陽谷縣第一人民醫院康復科