衰老相關基因Klotho的研究進展

郭煜暉 胡大軍 陳 靜 彭丹麗 李玉婷

(三峽大學，湖北 宜昌 443002)

衰老相關基因Klotho的研究進展

郭煜暉 胡大軍1陳 靜 彭丹麗 李玉婷

(三峽大學，湖北 宜昌 443002)

衰老；Klotho基因

隨著衰老研究及分子生物學的迅猛發展，衰老機制的研究已經走向分子與基因水平。Klotho基因是哺乳動物體內第一個過表達延長生命、低表達加速衰老的衰老抑制基因。Klotho基因在抗衰老及衰老相關疾病的發生中發揮著極為重要的作用，現將這方面的研究綜述如下。

1 Klotho基因的生物學屬性

Kuro-o等〔1〕首次從衰老小鼠中成功克隆Klotho基因，隨之發現大鼠和人也有Klotho基因，且它們之間具有較高(83%)的同源性。人和小鼠Klotho基因定位在第13號染色體區域，大鼠Klotho基因定位在第12號染色體區域，全長50 kb，包含5個外顯子。在Klotho基因結構中，其mRNA存在一個可變剪切位點，故而可產生膜型與分泌型兩種蛋白產物。人的膜型Klotho蛋白主要表達在腎臟、小腸、胎盤等臟器；分泌型Klotho蛋白與模型分布大致相同，分泌型Klotho蛋白無跨膜、胞內結構，主要以通過游離的形式行使其功能，血清中也含有Klotho蛋白〔2〕。Klotho基因突變的小鼠會過早出現與人類衰老相似的癥狀，且壽命縮短，而其過度表達會使小鼠壽命延長〔3〕。

2 Klotho基因的功能

2.1 保護腎臟 Kuro-o等〔1〕發現Klotho在腎臟中高表達，免疫組化和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析表明，Klotho基因高表達僅限于腎臟和腦脈絡膜〔4〕。Sugiura等〔5〕通過手術建立雙側腎損傷的大鼠模型，腎臟Klotho mRNA及其蛋白水平均明顯下降，需要很長時間才能恢復到對照組的水平；而經轉入Klotho基因處理后，治療組組織損傷程度小，血漿肌酐水平正常、凋亡細胞數量少，說明Klotho基因在腎臟損傷的恢復過程中發揮了重要作用。Haruna等〔6〕發現腎小球腎炎(ICGN)小鼠模型轉入Klotho(ICGN/ Klotho TG)處理后，較對照組其血肌酐水平、尿蛋白總量有所下降，此外，細胞間質、毛細血管、系膜等形態學方面均有明顯改善，死亡率明顯降低，并認為Klotho基因可以保護腎臟。有學者研究，給大鼠持續少量泵入兩個銀原子(AgⅡ)，7 d后可出現腎損傷，出現蛋白尿增多，腎小球濾過率下降，轉入Klotho基因后，可使大鼠尿蛋白減少，并能防止腎小球濾過率進一步下降及小管上皮細胞的形態學損傷〔5〕。通過轉Klotho基因處理可上調抗感染性細胞因子白細胞介素(IL)-10表達，抑制氮氧化物和過氧化產物的生成，從而減輕腎損傷，保護腎臟〔7〕。

2.2 保護動脈 人類衰老過程與內皮細胞功能障礙密切相關，衰老是動脈粥樣硬化危險因素之一。出生4 w后的Klotho基因缺陷小鼠就出現主動脈、肌性動脈的粥樣硬化，轉入外源性Klotho基因的互補脫氧核糖核酸(cDNA)后，動脈硬化得到有效改善〔1〕。Nakamura等〔8〕發現，和野生型Klotho+/+大鼠相比，Klotho-/+大鼠的內皮細胞功能受損，一氧化氮(NO)生成減少，對乙酰膽堿的血管舒張反應隨之降低，血管內皮生長因子(VEGF)表達降低，VEGF可修護血管內皮，延緩細胞衰老〔9〕。這也表明血管內皮細胞NO與VEGF的合成都和Klotho基因的表達相關，Klotho基因可能通過促進NO合成和上調VEGF表達防止血管內皮細胞的衰老。Ohta等〔10〕把含有Klotho基因的質粒轉入Klotho基因敲出小鼠體內1 w，小鼠體內的超氧化物歧化酶(SOD)活力明顯提高，脂質過氧化物的生成減少，血漿中NO含量也升高，所以認為Klotho基因可以協調體內氧化與抗氧化間的平衡，保護血管內皮細胞功能。

2.3 對鈣、磷代謝的調節 Klotho基因敲除小鼠鈣、磷代謝明顯異常〔11〕。在1～2周齡的Klotho基因敲除小鼠就有高磷血癥和高鈣血癥表現，隨周齡的增長，鈣、磷代謝失調日趨嚴重。高鈣血癥使得主動脈血管中層鈣化，累及腎小血管受損。Tsujikawa等〔11〕發現限制維生素D的攝入可使Klotho-/-的小鼠血鈣、血磷、1，25二羥基維生素D3〔1,25-(OH)2D3〕濃度恢復正常、糾正各種衰老表現并延長其壽命(生存15 w以上)。而限制磷的攝入可糾正(FGF)23-/-小鼠的高磷血癥、各種衰老表現并延長其壽命〔12〕。研究發現，膜型Klotho蛋白可明顯增加纖維母細胞生長因子(FGF)23和受體的親和力，還可與FGF23一起抑制1α-羥化酶的基因Cyp27b1表達，從而減少1,25-(OH)2D3的合成〔13〕。因甲狀旁腺也表達模型Klotho，甲狀旁腺激素(PTH) 也是FGF23作用的一個靶器官，PTH可以增加Cyp27b1基因的表達和血漿中1,25(OH)2D3的水平，同時FGF23可增加編碼24-羥化酶的基因Cyp24表達，抑制腎臟對磷的重吸收和維生素D的生物合成〔14〕，血漿中FGF23水平升高后可造成磷的丟失和骨骼骨化功能障礙〔15〕。可見，Klotho與 FGF23共同完成鈣、磷的調節。

2.4 抗氧化與抗凋亡 活力氧(ROS)對組織損傷的作用日趨明顯，如氧化應激是急性腎損傷的重要發病因素之一，可以采取清除氧自由基的方法治療。應激下動物體內Klotho mRNA及其蛋白表達降低。Mitobe等〔16〕發現在過氧化氫誘導的氧化應激狀態下，小鼠腎臟Klotho基因表達下降低，腎內髓集合管3細胞凋亡增多，而此變化與時間、劑量改變呈正相關，可作為氧化應激下組織細胞凋亡的一項指標〔17〕。Haruna等〔6〕發現，在40 w時相比轉Klotho基因小鼠的腎組織凋亡細胞數，腎小球腎炎的小鼠模型明顯增多，凋亡蛋白Bax表達的上調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降。Yamamoto等〔18〕觀察通過Klotho高表達轉基因小鼠(EFmKLOTHO48)和野生小鼠尿中活體內DNA氧化損傷的生物標記(8-OhdG)的分泌量發現，野生型小鼠尿中8-OhdG分泌量明顯增多，為EFmKLOTHO48鼠的1倍，提示Klotho能對抗體內DNA的氧化損傷；百草枯是一種農用除草劑，能生成過氧化物。把百草枯放入HeLa細胞的培養基里，將可溶性的Klotho蛋白加入處理組中，觀察它們各自細胞脂質過氧化的變化。相比對照組，處理組的脂質過氧化較輕;此外，將加入百草枯中國倉鼠卵巢細胞(CHO)培養基與經過可溶性Klotho蛋白處理的處理組比較，發現處理組細胞凋亡明顯減少，上述實驗均可證明Klotho基因可以減少細胞凋亡，具對抗氧化應激。

3 Klotho基因抗衰老的主要機制

Kurosu等〔19〕用EFmKLOTHO46和EFmKLOTHO48與相同基因的野生小鼠比較，發現EFmKLOTHO46和EFmKLOTHO48兩組的小鼠壽命長。Ikushima等〔20〕人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)用Klotho蛋白處理后發現，衰老相關的β-半乳糖酐酶活性降低，p53與p21的表達明顯下降，說明Klotho基因通過抑制p53/p21的表達減緩細胞衰老。

Klotho基因的分泌型Klotho蛋白通過提高解毒有害ROS的能力，行使與抗衰老激素一樣的功能。Klotho基因過表達的小鼠體內Klotho蛋白表達增強時，胰島素含量也隨之升高；反之，Klotho基因缺陷小鼠體內Klotho基因缺失時，胰島素含量也隨之下降，這種小鼠對胰島素敏感度很高，可以得知Klotho蛋白與胰島素含量變化密切相關，參與胰島素的抗性全過程〔19〕。當使用遺傳學方法對Klotho基因缺陷小鼠同時進行胰島素(INS)/胰島素樣生長因子(IGF)-1通路干涉處理后，可使Klotho基因缺陷小鼠的衰老癥狀明顯緩解。

Klotho基因能調控多個離子通道和生長因子的活動，包括INS、IGF-1和Wnt，對多種靶器官發揮生理效應〔21,22〕。Klotho蛋白通過與細胞膜表面特定受體結合而啟動了胞內的信號轉導過程，該信號傳遞可以抑制其下游的INS和IGF-1的胞內信號傳遞，因此出現胰島素抗性，如特定的靶酶磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB又稱為Akt)的磷酸化過程均被抑制〔23〕，而導致Akt的去磷酸化,后者又抑制叉頭轉錄因子(FOXO)1、FOXO3a、FOXO4等轉錄因子的磷酸化。FOXO家族成員FOXO1、FOXO3a、FOXO4在信號轉導通路上起了很重要的作用，Kyoung Kim等〔24〕篩選出穩定表達FOXO3a siRNA的人二倍體成纖維細胞(HDFs),發現下調HDFs中FOXO3a RNA和蛋白導致許多衰老形態出現,包括細胞形態的改變、細胞增殖速度減慢、SA-β-gal染色增加及上調p53/p21蛋白的表達。FOXO3a的活力可受磷酸化、乙酰化和蛋白水解調節,其中磷酸化是最主要的調節方式，而PI3K/Akt又是磷酸化FOXO3a最重要的信號通路。一旦INS/IGF-1/PI3K/Akt信號轉導通路被抑制就會激活FOXO，而抑制FOXO的磷酸化，并促進它的核遷移〔25〕。進而直接調控并且促進SOD2(MnSOD)的表達，有利于活性氧類物質撤除和對氧化應激的抵抗，并最終抑制衰老〔18,26〕。以上研究表明，Klotho蛋白通過調節細胞信號轉導通路而達到抗衰老，且抗衰老作用與抵抗氧自由基緊密相關。

綜上，Klotho基因同時具有配體、受體和酶的功能，有調節鈣磷代謝、抗氧化、抗凋亡的作用并以此實現對臟器的保護，在衰老過程中所起的作用日益明確，為揭示衰老發生機制提供了可靠的依據。進一步對Klotho蛋白的具體信號轉導通路的過程(其中涉及信號轉導體及這些信號與其他衰老途徑的關系)進行研究，有望在實踐中通過對Klotho基因表達的調控對衰老及衰老相關疾病提供一種新的治療方法。

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〔2015-10-16修回〕

(編輯 苑云杰/杜 娟)

國家自然科學基金青年項目(81403307)

郭煜暉(1983-)，女，博士，副教授，主要從事藏象理論及衰老研究。

R339.3+8

A

1005-9202(2017)03-0759-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.105

1 宜昌市第二人民醫院 三峽大學第二人民醫院