傳染性造血器官壞死病毒研究進(jìn)展

茆安婷 ， 尹玉偉 ， 代 靜 ， 郭曦堯 ， 李 東 ， 李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

傳染性造血器官壞死病毒研究進(jìn)展

茆安婷 ， 尹玉偉 ， 代 靜 ， 郭曦堯 ， 李 東 ， 李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

傳染性造血器官壞死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus，IHNV)，彈狀病毒科，諾拉彈狀病毒屬[1]作為傳染性造血器官壞死病(Infectious heamatopoietic necrosis，IHN)的病原體，是一種線性單鏈RNA病毒，最早在20世紀(jì)50年代在北美西部華盛頓及俄勒岡州于紅大馬哈魚(Oncorhynchus nerka)孵卵期的魚苗身上首次被發(fā)現(xiàn)[2]，并迅速蔓延到歐洲和亞洲，在全世界鮭鱒魚類中流行[3]。該病毒具有高度的傳染性，在水溫為10 ℃～12 ℃時(shí)，死亡率為50%～80%，最高可達(dá)100%[4]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)已將其列為必須申報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類疫病[5]。美國(guó)生物信息中心(the National Center for Biotechnology Information, NCBI)已經(jīng)錄入了4個(gè)IHNV的全基因組序列，檢索號(hào)依次為X89213[6-7]、L40883[8]、GQ413939/HM461966[9]和JX649101，均為來自不同區(qū)域具有不同生物學(xué)特征的IHNV毒株。國(guó)外對(duì)IHNV的生物學(xué)特性研究、致病機(jī)理[10-11]及疫苗研究[12-14]已深入開展，為病毒流行區(qū)域的IHN提供有力的數(shù)據(jù)支撐[15]。

1 IHNV的生物學(xué)特性

IHN病毒含有1條線性反義單鏈的RNA，具有二十面體立體對(duì)稱核衣殼結(jié)構(gòu)，彈狀病毒科，有囊膜，大小約120～300 nm×60～100 nm，體軸孔直徑20 nm，核心直徑60 nm。脂蛋白包膜厚度15 nm,其表面有纖細(xì)的刺突(Wolf，1988)。不耐酸和熱，對(duì)氯仿、甘油和乙醚較敏感。4 ℃環(huán)境下在脾臟、卵巢以及腦勻漿中可以短期保存，感染能力可維持?jǐn)?shù)周時(shí)間。細(xì)胞培養(yǎng)可采用胖頭鱥細(xì)胞系(FHM)、虹鱒魚性腺細(xì)胞(RTG-2)、大鱗大馬哈魚性腺細(xì)胞(CHSE-214)、鯉魚上皮瘤細(xì)胞(EPC)等，其中FHM和EPC較為敏感，最適培養(yǎng)溫度15 ℃～20 ℃。細(xì)胞病變時(shí)核染色質(zhì)趨向邊緣、顆粒狀，核膜肥厚，核變大，有時(shí)出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，細(xì)胞變圓脫落，空斑邊緣處細(xì)胞互相牽連，堆積呈葡萄狀，然后崩解[16]。

2 結(jié)構(gòu)蛋白特征

IHNV的基因組RNA中含有11 131個(gè)堿基，3′端的前導(dǎo)區(qū)由60個(gè)不被翻譯的堿基組成，之后依次為核衣殼蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、表面糖蛋白(G)、獨(dú)特的非病毒結(jié)構(gòu)蛋白(NV)、聚合酶(L)，最后為101個(gè)堿基組成的尾隨序列(Winton等，2002)。其中N蛋白是IHNV最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，負(fù)責(zé)保護(hù)RNA免受核酸酶降解，為轉(zhuǎn)錄和復(fù)制提供完整的模板。G蛋白是一種單一的I型跨膜糖蛋白，決定病毒的毒力。L蛋白是傳染性造血器官壞死病毒最大的結(jié)構(gòu)蛋白，具有多種酶活性，最主要的功能是斜帶RNA聚合酶。M蛋白在宿主細(xì)胞中抑制基因的轉(zhuǎn)錄，繼而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞程序性死亡。將IHNV根據(jù)基因型分類，依據(jù)病毒糖蛋白基因的第303個(gè)核苷酸發(fā)育系統(tǒng)可以分為U基因型、M基因型和L基因型三類[17]。相對(duì)于U基因型與L基因型，M基因型的毒株具有更高的多樣性[18]。雖然在蛋白質(zhì)表達(dá)方面具有極大差異，但I(xiàn)HNV只有一個(gè)血清型，毒株之間具有很高的核苷酸相似性(沈佳麗等，1998)。

3 發(fā)病特征

尸檢時(shí)肝和脾通常顯蒼白，腹腔存有血樣液體，消化道中缺少食物，胃內(nèi)充滿乳白色液體，腸內(nèi)充盈黃色液體；成魚在后腸和脂肪組織中可見瘀斑狀出血。

病魚的特征性壞死多發(fā)生于前腎、脾中，在骨胳肌上也可能出現(xiàn)病灶性出血；腸黏膜下層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是嚴(yán)重壞死的標(biāo)志；病灶樣壞死存在于肝和胰腺組織。血液中嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，血紅蛋白和血細(xì)胞容量比值下降。垂死魚由腎竇充血，最終因腎臟衰竭而導(dǎo)致死亡[19]。

4 不同毒力的IHNV對(duì)機(jī)體的影響

病毒的傳播關(guān)鍵取決于感染宿主的能力，同一病毒不同毒力的菌株可能會(huì)存在競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然，各種其他參數(shù)也有助于病毒傳播的能力，如復(fù)制、脫落和感染持續(xù)時(shí)間，這些都是由病毒和宿主等因素造成的[20]。不同毒力的IHNV對(duì)宿主侵染力存在差異，通過大量中外文獻(xiàn)資料可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)虹鱒魚分別用強(qiáng)毒IHNV(HV)和弱毒IHNV(LV)侵染，HV對(duì)機(jī)體的侵染更強(qiáng)，同時(shí)隨著機(jī)體感染病毒的時(shí)間越長(zhǎng)感染率就越高。根據(jù)機(jī)體健康的差異，病毒感染機(jī)體與機(jī)體注射病毒劑量比較，發(fā)現(xiàn)最明顯的毒力差異感染機(jī)體劑量是在中間范圍，因?yàn)樵跇O高或極低劑量感染飽和為100%或0%[21-22]。在IHNV流行前對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場(chǎng)水的病毒滴度低于0.07 PFU/mL，而IHNV流行早期階段對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)中水的病毒滴度測(cè)量值為50 PFU/mL，可以看出IHNV在養(yǎng)殖場(chǎng)中流行前后濃度并不是很高，這表明感染和流行的發(fā)生可能與基因型即毒力有關(guān)，與機(jī)體的健康差異關(guān)系不大；但當(dāng)試驗(yàn)魚的數(shù)量較大，即使在低劑量測(cè)試時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)小的誤差，即生物種群數(shù)量的傳染性差異。此外，當(dāng)魚體暴露在同一濃度，一小時(shí)、幾天或幾星期時(shí)，雖然感染時(shí)間增加但感染能力并沒有提高[23]。將兩種不同基因型的病毒即毒力不同的菌株HV和LV，以同一病毒濃度滴度同時(shí)感染機(jī)體時(shí)，在相同的暴露時(shí)間內(nèi)對(duì)機(jī)體內(nèi)病毒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)病毒基因HV始終高于LV，并且隨著機(jī)體暴露病毒的時(shí)間越長(zhǎng)HV在機(jī)體內(nèi)所占比例越大。這有可能是因?yàn)轸~群較長(zhǎng)的暴露于病毒從而導(dǎo)致病毒對(duì)魚群更多的感染，導(dǎo)致病毒復(fù)制動(dòng)力增強(qiáng)，HV可能與LV在機(jī)體內(nèi)存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[21-24]。通過IHNV對(duì)機(jī)體半數(shù)致死量(LD50)研究表明，不同毒力的IHNV感染過程與感染劑量和暴露時(shí)間有關(guān)，即同一毒力的病毒感染率隨著感染劑量和機(jī)體暴露時(shí)間成正比，不同毒力的病毒感染率隨著感染劑量和機(jī)體暴露時(shí)間成正比，同時(shí)還與毒力強(qiáng)弱有關(guān)，感染率高于死亡率。此外，隨著劑量的增加，會(huì)出現(xiàn)感染率的增加與死亡率相對(duì)較小的增加[25-28]。當(dāng)感染劑量從低到高增加時(shí)，感染率百分比也會(huì)隨之升高，但當(dāng)劑量達(dá)到一定值時(shí)，感染百分比達(dá)到100%，再增加劑量，感染百分比不會(huì)增加，但死亡率隨之增加，表明暴露劑量可以影響到死亡率。通過不同毒力IHNV感染機(jī)體計(jì)算的LD50和感染率比較，發(fā)現(xiàn)盡管在機(jī)體感染率HV和LV之間毒力差異顯著，但計(jì)算LD50并沒有顯著地差異，這是由于50%死亡率并不是由不同病毒的基因決定的，意味著病毒基因型的差異很難影響LD50的差異即死亡率[28-30]。這種規(guī)律是由于存在毒力動(dòng)力學(xué)量化差異。數(shù)據(jù)可能存在小范圍誤差，誤差產(chǎn)生的原因可能是一批魚類感染病毒的過程中，病毒會(huì)脫落到水中，可能導(dǎo)致多輪感染；剩余大量的魚存在潛在感染；不斷接觸病毒會(huì)迫使受感染的魚類轉(zhuǎn)移，使得感染導(dǎo)致死亡的發(fā)病率較高；非隔離處理和隔離處理可能會(huì)導(dǎo)致死亡率不同；在孵化場(chǎng)魚類高密度的情況下增加了受感染的魚和健康魚之間的接觸概率等[31-33]。雖然IHNV的傳染性的確與毒力有關(guān)，卻不是惟一驅(qū)動(dòng)因子，但可以說明毒力不同的IHNV對(duì)魚的感染性存在差異，為IHNV防治提供對(duì)比和參考。

5 IHN的防治

目前在對(duì)IHN的防治上較成熟的措施主要有兩個(gè)方面，一是抗病育種，即通過選擇或培養(yǎng)對(duì)IHNV敏感度小的鮭魚品種，或通過基因工程技術(shù)培育不敏感的二倍體或多倍體鮭魚品種；研究發(fā)現(xiàn)多倍體魚可有效降低感染IHNV后的死亡率，同時(shí)抗體滴度也顯著高于普通二倍體。而三倍體魚由于對(duì)IHNV的防御主要發(fā)生在細(xì)胞水平上，所以即可減少感染，同時(shí)也可將病毒細(xì)胞內(nèi)化[34]。二是通過對(duì)健康魚體進(jìn)行早期的免疫接種，使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防病毒感染的作用。目前已研制出來三類疫苗，滅活苗、減毒疫苗和重組疫苗。重組疫苗又包括DNA疫苗、N、G蛋白亞單位疫苗和合成肽疫苗。其中DNA疫苗目前是最成熟的疫苗，Andersonetal首次報(bào)道了IHNV DNA 疫苗的應(yīng)用，通過使用含有IHNV G蛋白基因的質(zhì)粒免疫虹鱒魚可以誘導(dǎo)虹鱒魚產(chǎn)生針對(duì)IHNV 的保護(hù)性免疫[35]。近年來Alonsoetal研發(fā)了一種自殺型DNA 疫苗，由于自殺型DNA 疫苗使無DNA 疫苗殘留的魚體接種成為現(xiàn)實(shí)。因此隨著疫苗技術(shù)不斷完善，抗IHNV的DNA疫苗可能通過投喂的方式對(duì)魚體進(jìn)行免疫。IHNV 的DNA 疫苗CMV 啟動(dòng)子操縱IHNV G 蛋白基因的表達(dá)，已在加拿大被批準(zhǔn)商品化[36]。

6 展望

目前對(duì)IHN主要以預(yù)防為主，隨著對(duì)IHNV的深入了解，科技水平的提高，已經(jīng)在某種程度上預(yù)防及控制住了該病的流行，但仍未完全避免該病的發(fā)生，IHN一旦大范圍的暴發(fā)，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)將造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，所以做好預(yù)防工作十分必要。然而目前并沒有特效的防治藥物，通過查閱大量的中外文文獻(xiàn)和報(bào)道，文章對(duì)IHNV的生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)理、不同毒力的IHNV對(duì)魚的感染性分析和疫苗的研發(fā)等方面進(jìn)行了概述，發(fā)現(xiàn)IHNV毒力不同感染率不同，因此對(duì)IHN未來的防治藥物研發(fā)可以從毒力影響機(jī)制的差異性進(jìn)行，但要考慮機(jī)體耐藥性的產(chǎn)生。隨著藥物的更新?lián)Q代在治療其他疾病的過程中耐藥性普遍存在，而耐藥性的產(chǎn)生對(duì)治療疾病形成巨大的阻礙，同時(shí)隨著人們生活水平的提高對(duì)自身健康重視度也隨之提高，動(dòng)物機(jī)體的藥物殘留會(huì)直接或間接的影響到人們的身體健康。長(zhǎng)期攝入含有藥物動(dòng)物的動(dòng)物制品會(huì)導(dǎo)致超級(jí)病毒出現(xiàn)，對(duì)人們的健康及國(guó)家的經(jīng)濟(jì)都會(huì)造成影響。對(duì)此，我國(guó)傳統(tǒng)中藥對(duì)病毒具有抑制及治療作用，同時(shí)對(duì)受感染機(jī)體毒副作用小，因此結(jié)合IHNV生物學(xué)特征、發(fā)病機(jī)理、不同毒力對(duì)機(jī)體的感染差異可為日后IHNV的防治措施及藥物的研發(fā)提供新的思路及參考。

[1] Dietzgen R G, Calisher C H,Kurath G,etal. Famliy-Rhabdoviridae[J].Virus Taxonomy,2012, 686-713.

[2] Rucker R R , Whipple W J,Parvin J R,etal. A contagious disease of salmon possibly of virus origin[J]. Fish and Wild life Service,1953,35-46.

[3] Winton J R. Recent advances in detection and control of infectioushema to poietic necrosis virus in aquaculture[J]. Annual Review of Fish Diseases,1991, 83-93.

[4] Williams K , Blake S,Sweeney A,etal. Multiplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses[J]. Journal of Clinical Microbiology,1999 (37): 4 149-4 141.

[5] Wolf K. Fish viruses and fish viral diseases[M]. Ithaca: Cornell University Press,1998.

[6] Schutze H, Enzmann P J, Mundt E,etal. Identification of the non-virion(NV) protein of fish rhabdoviruses viral haemorrhagic septicaemia virus and infectious haematopoietic necrosis virus [J].Journal of General Virology,1996,77(6):1 259-1 263.

[7] Schutze H, Enzmann P J, Kuchling R,etal. Complete genomic sequence of the fish rhabdovirus infectious haematopoietic necrosis virus[J]. Journal of General Virology,1995,76(10):2 519-2 527.

[8] Morzunov S P, Winton J R, Nichol S T. The complete genome structure and phylogenetic relationship of infectious hematopoietic necrosis virus[J]. Virus Resrarch, 1995, 38(2-3):175-192.

[9] Ammayappan A , LaPatra S E, Vakharia V N. Molecular characterization of the virulent infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV) strain 220-90[J]. Virology Journal,2010,7:10.

[10] Ammayappan A, Vakharia V N. Nonvirion protein of novirhabdo virus suppresses apoptosis at the early stage of virus infection[J]. Journal of Virology, 2011, 85(16) : 8 393-8 402.

[11] Thoulouze M I, Bouguyon E, Carpentier C,etal. Essential role of the NV protein of novirhabdo virusfor pathogenicity in rainbow trout[J]. Journal of Virology, 2004, 78(8) :4 098-4 107.

[12] Gael K, Kyle A, Garver,etal. Protective immunity and lack of histopathological damage two years after DNA vaccination against infectious hematopoieticnecrosis virus in trout[J]. Vaccine,2006, 24 (3) :345-354.

[13] LaPatra S E, Corbeil S, Jones G R,etal. Protection of rainbow trout against infectious hematopoieticnecrosis virus four days after specific or semi-specific DNA vaccination[J]. Vaccine, 2001, 19 (28-29) :4 011-4 019.

[14] Marta A, Peter P Chiou, Jo-Ann Leong. Development of a suicidal DNA vaccine for infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV)[J]. Fish and Shellfish Immunology, 2011, 30( 3) : 815-823.

[15] 徐黎明，劉淼，曾令兵，等.一株傳染性造血器官壞死病病毒的致病性研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014, 38(9)：1 584-1 591.

[16] 徐立蒲，王小亮等.傳染性造血器官壞死病診斷及防控的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013,40(3)：209-215.

[17] Garver K A , Troyer R M, Kurath G. Two distinct phylogenetic clades of infectious hematopoietic necrosis virus overlap within the Columbia River basin[J]. Diseases of Aquatic Organisms,2003,55: 187-203.

[18] Ma, Michelle D , Penaranda,etal. In vivo fitness correlates with host-specific virulence of Infectious hematopoieticnecrosis virus (IHNV) in sockeye salmon and rainbow trout[J]. Virology, 2011(417) : 312-319.

[19] 吳金爐，曾志楠.魚類病毒與魚類病毒疫苗[J].海洋科學(xué)，1999(4):37-42.

[20] Wargo A R , Kurath G.Virus fitness Definitions, measurements, and currentinsights. Curr. Opin. Virol. 2012,2: 538-545.

[21] Wargo A R , Garver K A , Kurath G. Virulence correlates with fitness in vivofor two M group genotypes of Infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV).Virology , 2012,404: 51-58.

[22] Wargo A R , Kurath G. In vivo fitness associated with high virulence in avertebrate virus is a complex trait regulated by host entry, replication, and shedding [J]. J. Virol, 2011,85: 3 935-3 967.

[23] Zhang, Y , Congleton. Detection of infectious hematopoietic necrosis(IHN) virus in rearing units for steelhead before and during IHN epidemics[J]. J.Aquat Anim Health, 1994, 6: 281-287.

[24] Troyer R M, Garver K A,Ranson J C,etal. In vivo virusgrowth competition assays demonstrate equal fitness of fish rhabdovirus strains that co-circulate in aquaculture[J]. Virus Res,2008, 137: 179-188.

[25] Pe～naranda, M M D , Purcell,etal. Differential virulencemechanisms of infectious hematopoietic necrosis virus in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) include host entry and virus replication kinetics[J]. J. Gen Virol, 2009, 90: 2 172-2 182.

[26] Overli, O, Winberg S,Pottinger T G,etal. Behavioral and neuroendocrinecorrelates of selection for stress responsiveness in rainbow trout—a review.Interg. Comp. Biol, 2005,45: 463-474.

[27] Bootl, L M , Leong J A C,Wao P T K,atal. Infectious hematopoietic necrosis virus. In: FishDiseases and Disorders, Vol. 3 Viral, Bacterial, and Fungal Infections. CAB International Publishing, Cambridge, MA, pp, 2011,66-109.

[28] Breyta, R, Jones A,Karath G,etal. Differential susceptibility in steelhead troutpopulations to an emergent MD strain of infectious hematopoietic necrosis virus[J]. Dis. Aquat. Org, 2014,112, 17-28.

[29] Rodrigues P, Margheri A C. Heterogeneity insusceptibility to infection induces unexpectedly high reinfection rates[J]. J. Theor.Biol 2009,259: 280-290.

[30] Gomes, M G M, Lipsitch M,Wargo A R,etal. A missing dimension in measures of vaccination impacts[J].PLoS Pathog. 2014,10(3).

[31] Regoes R R , Hottinger J W,Sygnarski L,atal. The infection rate ofDaphnia magna by Pasteuria ramosa conforms to the mass-action principle.Epidemiol[J].Infection 2003,131: 957-966.

[32] Van der Werf, W, Hemerik,etal. Heterogeneous hostsusceptibility enhances prevalence of mixed-genotype micro-parasiteinfections[J]. PLoS Comp, 2011, Biol,7 (6).

[33] Kurath, G, Wargo.Evolution of viral virulence: empirical studies. In:Weaver, S.C, Denison, M, Roossinck, M, Vignuzzi, M. (Eds.). Virus Evolution[J].Caister Academic Press, Poole, U K, 2015，155-214.

[34] Lapatra S E , Lauda K A , Jones G R，etal. Susceptibility and humoral response of Brown trout X lake trout hybrids to infectious hematopoietic necrosis virus：a model for examining disease resistance mechanisms[J].Aquaculture,1996,146(3):179-188.

[35] Anderson E D, Mourich D V, Fahrenkrug S C,etal.Genetic immunization of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)against infectious hematopoietic necrosis virus[J].Molecular Marine Biology and Biotechnology,1996,5(2):114-112.

[36] Salonius K, Simard N, Harland R,etal. The road to licensure of a DNA vaccine[J].Current Opinion in investigational drugs,2007,8(8): 635.

S941.414

A

0529-6005(2017)10-0079-03

2017-05-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(30972191)

茆安婷(1992-)，女，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物微生物與魚病防治，E-mail:569711008@qq.com

李月紅，E-mail: liyhong@sina.com