經典Wnt/β-catenin信號通路抑制因子NKD1在腫瘤中的表達

趙麗楠 王洪武 夏海波 王翠英 綦會霞 張俊毅 王玉敏

(赤峰學院醫學院附屬醫院中心實驗室,內蒙古 赤峰 024005)

經典Wnt/β-catenin信號通路抑制因子NKD1在腫瘤中的表達

趙麗楠 王洪武1夏海波2王翠英3綦會霞3張俊毅4王玉敏3

(赤峰學院醫學院附屬醫院中心實驗室,內蒙古 赤峰 024005)

NKD1;Wnt/β-catenin信號通路

裸角質膜同源蛋白(dNKD)最早是在果蠅體內發現的，其基因突變是引起果蠅分節運動缺失的主要誘因〔1〕。隨后，dNKD的兩個同系物NKD1及NKD2在哺乳動物體內被發現〔2〕，二者分別位于人染色體16q12.1和5p15.3，具有43.8%的高度同源性。NKD1的生物學作用使其可以參與經典Wnt/β-catenin 信號通路，從而影響腫瘤的發生發展和轉歸，另外，它還是評估腫瘤患者預后的輔助指標之一。

1 NKD1 的分子特征和組織表達特異性

Wnt信號通路是體內重要的信號通路之一，在多細胞生物體軸分化過程中承擔著非常重要的作用，還參與大腦及脊椎動物的肢體起始和頂端外胚層脊的形成，調控干細胞的生長發育。研究顯示，許多腫瘤的發生發展都與Wnt信號通路異常表達有關〔3〕。研究〔4,5〕認為NKD1是Wnt通路的拮抗劑，廣泛表達于多種正常組織中，NKD1在胞質中通過其EF手型結構域(EF-Hand)與蓬亂蛋白(Dvl)的盤狀同源區域(PDZ)區域結合后，阻滯經典Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，并通過活化c-Jun氨基末端激酶(c-JNK)基因調控上皮細胞的極性，間接抑制腫瘤的發生。

2 NKD1與Wnt/β-catenin信號通路的關系

研究〔6〕證實，許多腫瘤的發生發展都涉及Wnt通路。Wnt信號在細胞內有兩條通路〔7〕，即經典Wnt/β-catenin通路和非經典Wnt/β-catenin通路。在經典Wnt/β-catenin通路中，配體分子Wnt 與七次跨膜受體(Fz) 和其輔助受體低密度脂蛋白相關受體(LRP)5/6結合。Wnt-Fz-LRP6復合體募集支架蛋白(Axin)和Dvl，引起LRP6磷酸化，然后將Axin聚集到受體復合體，阻止Axin介導的β-catenin的磷酸化，穩定β-catenin活性，使β-catenin聚集在胞質內并進入細胞核，結合轉錄因子T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)形成復合體，激活受Wnt通路調控的一些目標基因的表達〔8〕。當Wnt不存在時，β-catenin會與抑癌基因(APC)、Axin、酪蛋白激酶(CK)1和糖原合成酶激酶(GSK)3 形成復合體，然后被CK1 和GSK3相繼磷酸化。磷酸化的β-catenin被E3泛素連接酶識別β-轉導重復相溶蛋白(Trcp)并降解，進而TCF-LEF/Groucho和組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)抑制受Wnt調控的靶基因表達〔9〕。非經典Wnt/β-catenin有兩條細胞內途徑：①平面細胞極性通路(PCP)，在PCP通路中，Fz與配體結合后，通過Dvl將信號傳導至小分子G蛋白Rac和Rho，激活下游靶基因，通過調控肌動蛋白的活性影響細胞骨架重新排列。②Wnt/Ca2+通路，Wnt信號能夠通過Dvl、Fz和G-蛋白的傳導，釋放細胞內的Ca2+，Ca2+可以提高蛋白激酶(PK)C、磷酸酶(PL)C和鈣調蛋白激酶(CamK)2等酶的活性，影響細胞的生物學功能。這兩條途徑在細胞的增殖與分化、神經發育及體軸形成等生物學過程中起至關重要的作用。Dvl是Wnt信號通路上游的一個效應分子，是PCP通路、經典Wnt/β-catenin通路及Wnt/Ca2+通路的重要調控因子。一些能夠與Dvl結合的蛋白可以改變Dvl的蛋白水平，這其中就有NKD1蛋白。研究表明，NKD1 對存在于細胞不同部位的β-catenin有著不同的作用，如NKD1是細胞質中β-catenin蛋白的下游調節因子，主要維持穩定β-catenin蛋白的水平，阻止β-catenin向胞核聚集;而細胞核內的β-catenin，NKD1是其上游調控基因，對β-catenin的核內累積有著負調控作用。

NKD1在細胞質中可以通過其EF-Hand與Dvl的PDZ結構域相結合后，作為Wnt/β-catenin通路的負調控因子發揮作用〔4,5,10,11〕，抑制Wnt/β-catenin信號通路的功能。NKD1可作為引導開關，使Dvl由Wnt/β-catenin通路向JNK/PCP通路轉化，進而抑制經典通路。Wnt途徑控制脊椎動物細胞極性及細胞遷移，可被用來辨別瘤形成情況，因此Wnt途徑的抑制物NKD1同樣能夠調節腫瘤的形成和發展，具有重要意義。

3 NKD1在各種腫瘤中的表達和作用

關于 NKD1 與腫瘤的關系鮮有報道，目前的研究〔3〕證明，NKD1在胃癌、直腸腺瘤、結直腸癌及乳腺癌中的蛋白表達水平是下降的，而且它的表達水平與腫瘤的分化程度、轉移及預后有關。其他研究〔6〕顯示，在肝母細胞瘤和直腸癌中NKD1的mRNA水平是上升的，奇怪的是，在非小細胞肺癌(NSCLC)中卻存在NKD1 mRNA 高表達而蛋白低表達的現象，且造成該蛋白低表達的原因與臨床病理因素有密切的關系。即NKD1在不同來源的腫瘤中其蛋白及mRNA的表達情況尚存在較大爭議〔12,13〕。

3.1 NKD1在結直腸癌中的表達 消化道腫瘤的發生與Wnt信號通路的異常激活有著密不可分的關系。統計表明，90%以上的人類結直腸癌中都存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活及胞內β-catenin的累積[14，15]。因此，作為Wnt通路中最關鍵的因素之一，NKD1受到越來越多研究者們的重視。

免疫組化檢測顯示，結直腸癌患者術后癌癥組織中NKD1表達的陽性率明顯低于正常組織，NKD1的表達水平還和腫瘤的杜克(Dukes)分期、淋巴結轉移及細胞增殖抗原標記物(Ki67)的表達有關，生存分析顯示若NKD1表達水平較低，則患者的預后較差。因此，結直腸癌中NKD1的表達水平對疾病的發生發展起著關鍵作用，其表達水平的高低可能對判斷患者預后會有一定的價值〔14〕。最近研究表明，NKD1 在正常組織中的陽性率明顯高于結直腸腺瘤、結直腸癌，其表達水平與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移及Dukes分期密切相關，差異有統計學意義〔15〕。研究證明，結直腸腫瘤中β-catenin的蛋白表達水平下降是由NKD1所調控的〔5〕。Guo等〔16〕通過對NKD1缺陷的結直腸癌細胞進行研究，發現NKD1的缺失能加強細胞中β-catenin的穩定性且促進細胞增殖，這暗示著NKD1可能在對β-catenin的調控上發揮作用，即Wnt信號通路的負反饋調節是通過NKD1對β-catenin核聚集的負向調控來完成的。因此，NKD1可能與結直腸癌的發生發展密切相關。同時，聯合檢測β-catenin和NKD1的表達水平，可能為結直腸腫瘤的臨床診斷及預后評估提供一定幫助。

3.2 NKD1在肺癌中的表達 NKD1在不同來源的腫瘤中的表達尚存在較大爭議，在同一來源的腫瘤中其蛋白及mRNA的表達也存在不同情況。在NSCLC中NKD1蛋白的表達量遠遠低于癌旁肺組織，但mRNA的表達卻顯著高于癌旁肺組織，這個結果與已經證實的在不同來源腫瘤中表達的報道相同，但同時也顯示即使在相同腫瘤中，NKD1的蛋白水平與mRNA表達水平也可能不同〔17〕。其原因可能由于NKD1蛋白表達下調，導致其失去了對Wnt信號通路活性的抑制作用，所以在肺癌組織中，NKD1蛋白表達水平明顯低于周邊肺組織，但其mRNA水平為什么高于周圍正常肺組織呢，有報道認為NKD1本身也是經典Wnt信號通路的下游靶基因之一〔18〕，其mRNA表達上升，可能與肺癌組織中Wnt信號通路的高度激活狀態相關，經典Wnt通路的高活性，可以使NKD1轉錄活性增強，導致mRNA出現高度表達狀態。然而mRNA高表達，其蛋白水平卻又明顯下降，這可能與翻譯后修飾及NKD1蛋白的降解增強有關。Yan等〔5〕則認為，在生物體內存在著調節NKD1表達的一種負反饋機制，因此如果NKD1蛋白高表達，Wnt信號通路的活性就會受到抑制，于是NKD1的轉錄活性下調;然而如果NKD1蛋白表達下降，Wnt信號通路的活性就會增加，進而加快了NKD1的轉錄及翻譯，導致NKD1的mRNA水平上升。但目前只是推測，具體的原因和生物學機制還需要更深入的研究。趙月等〔17〕研究表明在NSCLC里，NKD1的蛋白低表達與NSCLC的淋巴結轉移、低分化、高腫瘤淋巴結轉移(TNM)分期及不良預后等有密切關聯。研究表明79%的NSCLC新鮮組織標本中NKD1的蛋白表達水平顯著低于相應的癌旁正常肺組織，而 mRNA 表達水平則顯然高于正常的肺組織。免疫組織化學數據顯示在 78% 的 NSCLC標本中NKD1的表達明顯低于正常肺組織〔19〕。這個發現雖然和已有的在不同來源腫瘤中存在表達的結果相一致，但也顯示了在同一腫瘤中，NKD1的蛋白表達與mRNA的表達水平并不完全相同。其研究結果還證實在NSCLC 中腺癌NKD1 的表達高于鱗癌，與分化程度正相關，與淋巴結轉移和 TNM 分期負相關，并且NKD1表達較低的患者術后生存時間明顯低于正常表達者。總之，在 NSCLC 里NKD1的蛋白表達水平是下調的，而mRNA 的表達水平卻是上調的，而且患者的臨床病理因素和不良預后都與NKD1的蛋白水平下調程度有關。肺腺癌研究顯示，40例肺腺癌中有8例NKD1的表達下調，15例NKD1正常表達，15 例NKD1高表達。而NKD1的低表達與淋巴結轉移具有一定的關聯性〔20〕，所以，NKD1可作為肺腺癌預后的標志因素。

3.3 NKD1在乳腺癌中的表達 陳巍等〔21〕用免疫組化方法檢測了人乳腺癌細胞中β-catenin蛋白與NKD1的表達關系。其結果顯示，對照組中NKD1和β-catenin蛋白的表達水平顯著高于實驗組，且實驗組中NKD1和β-catenin蛋白的表達與腫瘤的臨床分期、淋巴結轉移、脈管浸潤的表達關系密切;實驗組中β-catenin和NKD1的表達正相關，生存分析結果顯示β-catenin和NKD1表達水平較低的患者預后較差。表明這兩種蛋白均與乳腺癌的發生發展有關聯，也可以說二者在腫瘤的脈管散播過程有重要作用，Wnt/β-catenin通路可能是介導NKD1蛋白發揮其生物學作用的途徑。或者是通過血管內皮生長因子的調控發揮作用。β-catenin和NKD1之間可能存在通路作用，參與了腫瘤細胞外細胞連接的改變，協同加快腫瘤的生長、侵襲及轉移。由于腫瘤中NKD1的異常表達導致Wnt/β-catenin經典通路產生障礙，促使胞質內還沒有被磷酸化降解的β-catenin進入細胞核內，結合TCF/LEF形成復合體，進而啟動下游相應目標基因的轉錄，加快腫瘤的侵襲和轉移。此機制可能與癌基因的作用有關，同時也是腫瘤生長轉移過程中的生物學行為特征之一。乳腺癌中β-catenin蛋白和NKD1具有協同作用，二者的共同低表達加快了腫瘤的發生發展。

3.4 NKD1與骨肉瘤(OS)轉移 OS是兒童和青少年易患的疾病，是臨床上常見的原發性惡性骨腫瘤之一。其惡性程度較高、血行轉移發生早、容易發生肺轉移、病情發展快速且死亡率特別高，因此，精確地對OS做出早期診斷和有效抑制或者阻斷OS的轉移，已經成為治療OS的重中之重。閆康〔22〕研究發現，Wnt 信號通路中的NKD1 在具有高轉移性的OS細胞系 F5M2 中呈現高表達狀態，提示NKD1 可能促進OS的轉移。若改變OS細胞中miR-195 的表達水平可以相應改變NKD1 的表達量。研究顯示，骨樣骨瘤組織和骨軟骨瘤組織中NKD1 蛋白表達陽性率顯著低于OS組織;但是骨軟骨瘤NKD1 蛋白表達陽性率與骨樣骨瘤組織 NKD1 蛋白表達的陽性率無明顯差異。同時，NKD1 的表達還與OS是否發生轉移及患者 3 年生存率顯著相關，而與年齡、性別、組織學分級、腫瘤發生部位、腫瘤大小及組織學分型等臨床表型無明顯相關性。

綜上，腫瘤發生與NKD1表達具有重要關系，其發揮作用的途徑主要依賴于Wnt信號傳導通路，NKD1能抑制該通路的激活作用，抑制癌癥發生。當NKD1表達水平下降時，Wnt信號通路被激活，引起β-catenin進入胞質及細胞核，促進腫瘤浸潤及轉移。因此，NKD1對β-catenin的調控有極為重要的作用，但是對于分布在細胞不同部位的β-catenin，NKD1對其有著不同的作用。同時，NKD1還與不同腫瘤的分期、轉移及預后有關。總之，NKD1可作為臨床上治療腫瘤的作用靶點，具有一定的臨床意義。

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〔2016-01-04修回〕

(編輯 苑云杰/王一涵)

國家自然科學基金項目(No.81260196)；國家社科基金項目(No.13CRK009);內蒙古自治區高等學校青年科技英才支持計劃(No.NJYT-13-B20)；內蒙古自治區高等學校科學研究項目(No.NJZZ12306，NJZZ14271)；內蒙古自然科學基金項目(No.2014MS0892,2014BS0814，2013MS1176)

1 乳腺外科 2 泌尿外科 3 腫瘤內科 4 病理科

王玉敏(1981-)，女，副教授，博士，碩士生導師，主要從事氧化損傷與疾病研究。

趙麗楠(1988-)，女，初級檢驗師，碩士，主要從事腫瘤機制研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1786-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.095