BCL6B對人結直腸癌LoVo細胞增殖和遷移的影響及機制

谷 月， 李愛芳， 孫 暉， 李雪茹， 查 何， 趙佳麗， 謝佳卿， 周 蘭

(重慶醫科大學檢驗醫學院，臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016)

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BCL6B對人結直腸癌LoVo細胞增殖和遷移的影響及機制

谷 月， 李愛芳， 孫 暉， 李雪茹， 查 何， 趙佳麗， 謝佳卿， 周 蘭△

(重慶醫科大學檢驗醫學院，臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016)

目的： 研究B細胞白血病/淋巴瘤6B(BCL6B)在人正常腸上皮細胞FHC及結直腸癌細胞LoVo中的表達水平及BCL6B對LoVo細胞增殖和遷移的影響，并探討其相關分子機制。方法: 采用RT-PCR及Western blot檢測FHC細胞和LoVo細胞中BCL6B的內源性表達；用脂質體法將重組質粒pcDNA3.1-BCL6B轉入LoVo細胞，運用MTT、集落形成、細胞劃痕及Transwell小室實驗檢測BCL6B對LoVo細胞增殖和遷移的影響，采用RT-PCR及Western blot檢測細胞周期蛋白D1(cyclin D1)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，Western blot檢測蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。結果: 與正常腸上皮細胞FHC相比，BCL6B在LoVo細胞中呈明顯低表達；轉染pcDNA3.1-BCL6B后的LoVo細胞內BCL6B水平顯著增高。過表達BCL6B的實驗組細胞72 h的增殖活性及劃痕愈合力分別較對照組降低28.33%(P<0.01)和36.11%(P<0.05)。實驗組細胞cyclin D1和MMP-9的mRNA水平分別降低39.90%(P<0.01)和77.36%(P<0.05)，同時cyclin D1、MMP-9和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的蛋白水平分別降低44.00%(P<0.05)、47.06%(P<0.01)和32.88%(P<0.05)。結論: BCL6B可抑制結直腸癌LoVo細胞的增殖和遷移，其機制可能涉及PI3K/AKT信號通路的抑制。

BCL6B； 結直腸癌； 細胞增殖； 細胞遷移； PI3K/AKT信號通路

結直腸癌作為消化道惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率分別位居世界第3位和第4位[1]。在我國隨著人口的老齡化及其它致癌因素的增加，結腸癌的發病率呈逐年上升趨勢，形勢十分嚴峻。現如今，外科手術和放化療方案雖有進展，然而轉移和復發仍是導致結直腸癌患者低生存率的主要因素。

研究表明，抑癌基因啟動子區域的高甲基化所導致的表達下調或缺失在結腸癌的發生和發展中起重要作用。B細胞白血病/淋巴瘤6B(B-cell leukemia/lymphoma 6 member B，BCL6B)基因屬于B細胞白血病/淋巴瘤6(B-cell leukemia/lymphoma 6，BCL6)超家族成員，其編碼的蛋白與BCL6具高度同源性，發揮著與BCL6相似的轉錄抑制功能[2-4]。然而，目前關于BCL6B在腫瘤中的作用及機制的報道甚少。已有的研究提示，BCL6B因啟動子區域高甲基化而導致的表達缺失存在于胃癌、肝癌及結直腸癌中，并且其啟動子區甲基化程度與腫瘤的惡性程度及患者不良預后呈正相關關系[5-8]。在結直腸癌細胞系中，BCL6B因啟動子區甲基化程度不一而呈現不同水平的表達；恢復結直腸癌細胞系中BCL6B的表達可激活P53信號通路而發揮腫瘤抑制作用[8]。

為進一步探討BCL6B對腫瘤的作用及可能機制，本研究檢測正常腸上皮細胞FHC及具有高轉移潛能的結直腸癌細胞LoVo中BCL6B的表達水平，探討BCL6B對結直腸癌細胞增殖及遷移侵襲的影響，并進一步探討其相關分子機制。

材 料 和 方 法

1 細胞系和質粒

人正常腸上皮細胞FHC及人結直腸癌細胞LoVo購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)；pcDNA3.1空載質粒和pcDNA3.1-BCL6B質粒由重慶醫科大學附屬第一醫院表觀遺傳學實驗室饋贈。

2 主要試劑和儀器

脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen；DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco；TRIzol試劑購自Invitrogen；反轉錄試劑盒購自TaKaRa；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；蛋白質提取相關試劑購自上海碧云天生物技術研究所；兔抗人BCL6B、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-AKT)和總蛋白激酶B(total protein kinase B，t-AKT)抗體均購自Santa Cruz；鼠抗人β-actin抗體購自Santa Cruz；山羊抗兔IgG/HRP標記購自Abgent；山羊抗鼠IgG/HRP 標記購自中杉金橋生物技術有限公司；MTT檢測試劑購自凱基生物。

3 方法

3.1 細胞培養與質粒轉染 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基常規培養LoVo細胞。實驗分為對照組(control組,轉染空載體pcDNA3.1質粒)和實驗組(pcDNA3.1-BCL6B組，轉染pcDNA3.1-BCL6B重組質粒)。以每孔2×105個的密度接種LoVo細胞至6孔板中，置于37 ℃、5%CO2的條件下培養，待貼壁細胞融合度約為70%時進行轉染。轉染流程參照Lipofectamine 2000說明書，每孔轉染質粒4 μg；于轉染后24 h或48 h收集細胞進行后續實驗。

3.2 RT-PCR 轉染后48 h收集細胞，用TRIzol法提取細胞總RNA，取800 ng總RNA在10 μL反應體系中反轉錄生成cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應，檢測細胞中目的基因和內參照基因的轉錄水平。GAPDH的上游引物序列為5’-CAGCGACACCCACTCCTC-3’，下游引物序列為5’-TGAGGTCCACCACCCTGT-3’；BCL6B的上游引物序列為5’-AAGCCGTATAAGTGTGAGACG-3’，下游引物序列為5’-AGAATGTGGTAGTGCAC-3’；cyclin D1的上游引物序列為5’-CTGGCCATGAACTACCTGGA-3’，下游引物序列為5’-GTCACACTTGATCACTCTGG-3’；MMP-9的上游引物序列為5’-CCTGGAGCCTGAGAACCAATC-3’，下游引物序列為5’-CCACCCGAGTGTAACCATGGC-3’。PCR 反應條件為：95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s, 63 ℃～54 ℃ 30 s，9個循環(每個循環依次降低1 ℃)，72 ℃ 30 s； 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 20～26個循環；最后72 ℃ 10 min。產物經瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀采集圖像，Quantity One軟件分析條帶灰度值，計算目的基因與內參照的比值。

3.3 Western blot法 轉染48 h后，收集細胞，按照蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白，分光光度儀測定其濃度。蛋白質煮沸10 min充分變性，經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉法轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，5% BSA封閉2 h，Ⅰ抗分別為鼠抗人β-actin(1∶3 000稀釋)、兔抗人BCL6B(1∶3 000稀釋)、兔抗人cyclin D1(1∶1 000稀釋)和兔抗人MMP-9(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，PVDF膜上滴加化學發光顯色液，Gel Doc凝膠成像儀上觀察結果，采集圖像，Quantity One軟件分析條帶的灰度值，計算目的蛋白與內參照的比值。

3.4 MTT比色法 收集轉染12 h后的細胞，調整細胞密度，分別接種于96孔板中，每組設5個復孔，每孔接種3×103個細胞，分別于接種后24 h、48 h、72 h和96 h時向每孔細胞中加500 mg/L MTT試劑10 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養4 h后，棄去上清培養基，加入200 μL DMSO，避光振蕩10 min，于光吸收酶標儀上檢測492 nm處吸光度(A)值。將5個復孔的平均值設為該組的A值，實驗重復3次。

3.5 平板集落形成實驗 細胞接種及轉染24 h后，分別取800個對照組和實驗組細胞接種于6孔板中，每組設3個復孔，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養2周左右，吸棄各孔培養基，PBS漂洗2次，每孔加500 μL甲醇溶液室溫下固定15 min，棄去固定液，然后每孔加1 mL結晶紫染液，避光條件下染色20 min，自來水沖洗后晾干，計算集落數。使用酶聯斑點圖像自動分析儀掃描拍照；按照“集落形成率(%)=集落數/接種細胞數×100%”的公式，計算集落形成率。

3.6 細胞劃痕愈合實驗 收集轉染后的各組細胞接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下常規培養，待細胞融合度達到90%時，用10 μL無菌槍頭在培養板中劃線，用力均勻、勿傾斜；PBS輕輕洗滌細胞2次；每孔加入無血清培養基2 mL，分別于劃痕后0 h、24 h、48 h和72 h拍照，獲取各組細胞同一部位不同時點的劃痕寬度，根據“劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-X h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%”的公式，計算相應時點細胞劃痕愈合率。

3.7 細胞侵襲實驗 采用Transwell小室進行檢測。基質膠與無血清培養基1∶5混合，各小室加32 μL稀釋后的基質膠，置37 ℃培養箱5 h。將上室(Transwell小室)放入下室(24孔板)中，收集各組細胞，制成單細胞懸液，每個上室加300 μL完全培養基含1×105個腫瘤細胞，下室加700 μL含20%胎牛血清的DMEM培養基；每組設3個復孔。于37 ℃、5% CO2孵育24 h后，取出小室，PBS洗2次，用棉簽拭去上室細胞及清除基質膠，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS清洗，晾干后于倒置顯微鏡下計數穿膜細胞數。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用Student’st檢驗。多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步采用Bonferroni校正的t檢驗進行組內兩兩比較。以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 BCL6B在正常腸上皮細胞FHC和結直腸癌細胞LoVo中的內源性表達及BCL6B重組質粒轉染效率的檢測

提取常規培養的FHC細胞和LoVo細胞的總RNA及總蛋白進行RT-PCR和Western blot實驗，結果顯示，FHC細胞和LoVo細胞BCL6B mRNA的校正灰度值依次為1.82±0.64和0.03±0.04，BCL6B蛋白的校正灰度值分別為1.36±0.20和0.02±0.03，即BCL6B在結直腸癌細胞LoVo中呈明顯低表達狀態，見圖1A。重組質粒pcDNA3.1-BCL6B轉染LoVo細胞48 h后，與轉入空載體組相比，BCL6B的mRNA及蛋白水平分別增加至8.84倍(P<0.01)和6.57倍(P<0.05)，說明轉染效率較高，見圖1B。

2 BCL6B對LoVo細胞增殖的影響

對照組在24 h、48 h、72 h和96 h的A值分別為0.27±0.02、0.42±0.03、0.62±0.04和0.81±0.07，實驗組A值則分別為0.26±0.02、0.31±0.02、0.41±0.03和0.48±0.05，實驗組各時點均低于對照組，其中72 h和96 h時的差異有統計學顯著性(分別P<0.01和P<0.05)，提示BCL6B抑制LoVo細胞的存活能力，見圖2A。

實驗組細胞集落形成率為(2.43±2.12)%，對照組為(19.64±3.21)%，實驗組低于對照組，差異有統計學顯著性(P<0.05)，說明BCL6B抑制LoVo細胞的集落形成能力，見圖2B。

3 BCL6B對LoVo細胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實驗結果顯示，24 h時2組細胞遷移能力的差異無統計學顯著性；48 h時實驗組LoVo細胞的劃痕愈合率為(28.21±4.06)%，顯著低于對照組的(50.72±4.89)%，差異有統計學意義(P<0.01)；72 h時，實驗組細胞劃痕愈合率為(52.01±5.11)%，顯著低于對照組的(81.41±2.80)%，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3A。

Figure 1.The endogenous BCL6B expression in the FHC cells and LoVo cells (A), and the expression of BCL6B in the LoVo cells after transfected with pcDNA3.1-BCL6B for 48 h (B) detected by RT-PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsFHC;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 BCL6B在FHC細胞和LoVo細胞中的內源性表達及LoVo細胞中BCL6B轉染效率的檢測

Transwell實驗的結果顯示，實驗組和對照組LoVo細胞的穿膜細胞數分別為(48±24)個和(192±31)個，差異有統計學意義(P<0.05),見圖3B。上述結果說明BCL6B能抑制LoVo細胞的遷移和侵襲能力。

4 BCL6B對LoVo細胞中cyclin D1和MMP-9 mRNA表達的影響

BCL6B重組質粒轉染LoVo細胞48 h后行RT-PCR，結果如圖4所示。對照組cyclin D1 mRNA校正灰度值為1.93±0.08，實驗組為1.16±0.05，差異有統計學意義(P<0.01)；對照組MMP-9 mRNA校正灰度值為0.89±0.12，實驗組為0.27±0.07，差異有統計學意義(P<0.05)，提示BCL6B下調這2種基因的轉錄。

5 BCL6B對LoVo細胞中cyclin D1、MMP-9、t-AKT和p-AKT蛋白水平的影響

BCL6B重組質粒轉染LoVo細胞48 h后的Western blot實驗檢測結果見圖5。對照組cyclin D1蛋白的校正灰度值為1.00±0.05，實驗組為0.56±0.06，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組MMP-9蛋白的校正灰度值為0.89±0.05，實驗組為0.45±0.04，差異有統計學意義(P<0.01)；對照組t-AKT蛋白的校正灰度值為0.84±0.05，實驗組為0.90±0.09，差異無統計學顯著性；對照組p-AKT蛋白的校正灰度值為0.73±0.03，實驗組為0.39±0.06，差異有統計學意義(P<0.05),提示BCL6B可下調腫瘤細胞中增殖和遷移相關蛋白的表達，且能抑制AKT的磷酸化。

Figure 2.The MTT assay (A) and colony formation assay (B) to measure the effect of BCL6B on the proliferation of the LoVo cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 MTT實驗和集落形成實驗檢測BCL6B對LoVo細胞增殖的影響

Figure 3.The effect of BCL6B on the migration (A, wound healing assay) and invasion (B, Transwell chamber experiment) of the LoVo cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 細胞劃痕和Transwell小室實驗檢測BCL6B對LoVo細胞遷移和侵襲的影響

Figure 4.The effect of BCL6B on the mRNA expression of cyclin D1 and MMP-9 in LoVo cells detected by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4 RT-PCR檢測BCL6B對LoVo細胞中cyclin D1和MMP-9 mRNA表達的影響

6 PI3K/AKT 信號通路對BCL6B引起的腫瘤相關蛋白表達變化的影響

將pcDNA3.1-BCL6B重組質粒及PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002共同處理LoVo細胞48 h后，Western blot實驗結果顯示cyclin D1、MMP-9和 p-AKT的蛋白水平明顯低于未用抑制劑處理的對照組和單獨用抑制劑處理組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。這一結果提示PI3K/AKT信號通路的抑制可能參與介導BCL6B對該細胞增殖和遷移的抑制。

討 論

BCL6B基因又稱作BAZF、ZBTB28及ZNF62，位于人17號染色體1區3帶1亞帶[2]。文獻報道BCL6B廣泛表達于人體正常組織，然而在很多腫瘤中存在不同位點的突變或缺失[9]，提示BCL6B可能為抑癌基因。同時研究發現BCL6B啟動子區域在腫瘤中普遍甲基化[10]。而目前關于BCL6B在腫瘤中的作用及機制的報道甚少。

本研究發現BCL6B在人正常腸上皮細胞FHC中高表達，在人結直腸癌細胞LoVo中呈明顯低表達。且Western blot實驗證實，瞬時轉染重組質粒pcDNA3.1-BCL6B可使LoVo細胞內BCL6B成功過表達。本研究中，MTT和集落形成實驗結果顯示BCL6B能有效抑制LoVo細胞的增殖活性；細胞劃痕及Transwell實驗結果表明BCL6B能顯著抑制癌細胞遷移和侵襲能力。這與2015年Hu等[8]報道的BCL6B對結直腸癌的抑制性作用是一致的。同時我們發現，BCL6B可下調 LoVo細胞中cyclin D1和MMP-9的mRNA和蛋白水平。Cyclin D1是細胞周期的重要調控者，可與細胞周期蛋白依賴性激酶4/6(cyclin-dependent kinases 4/6，CDK4/6)形成特異性的復合物，促進細胞周期由G1期進入S期[11-12]。MMP-9為基質金屬蛋白酶家族重要成員之一，其主要功能是降解IV型膠原，在腫瘤細胞突破基底膜屏障發生浸潤和遠處轉移過程中扮演重要角色[13-14]。進一步表明BCL6B抑癌功能的發揮可能與細胞周期阻滯和腫瘤細胞遷移侵襲能力減弱有關。

Figure 5.The effect of BCL6B on the protein levels of cyclin D1 and MMP-9 and the phosphorylation level of the AKT in LoVo cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 Western blot實驗檢測BCL6B對LoVo細胞中cyclin D1和MMP-9蛋白水平及對AKT磷酸化的影響

Figure 6.The effects of PI3K/AKT inhibitor LY294002 on the protein levels of cyclin D1, MMP-9 and p-AKT in the LoVo cells induced by BCL6B detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDMSO group;#P<0.05vsLY294002 group;△P<0.05vsBCL6B+DMSO group.

圖6 Western blot實驗檢測PI3K/AKT通路抑制劑LY294002對BCL6B引起的cyclin D1、MMP-9及p-AKT蛋白水平變化的影響

PI3K/AKT信號通路在結直腸癌的發生發展中發揮重要作用，其活化可促進癌細胞增殖，同時參與了結直腸癌的侵襲和轉移過程[15]。文獻報道，激活PI3K/AKT信號通路可增加cyclin D1表達，促進細胞周期；抑制該通路活性可抑制cyclin D1和CDK4的表達，同時可誘導細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A的表達，從而阻礙細胞周期進展[16]。結直腸癌的侵襲和轉移是影響其預后的重要因素，細胞外間質降解是腫瘤侵襲和轉移的重要步驟。Thant等[17]研究表明用PI3K抑制劑LY294002處理卵巢癌細胞，能強烈地抑制癌細胞中依賴纖連蛋白的MMP-9的分泌。同時，Ruhul等[18]研究發現AKT陰性表達體或LY294002均能抑制IL-1β依賴的MMP-9的分泌。另有文獻報道在C6神經膠質細胞瘤細胞株中，LY294002能顯著減少p-AKT介導的MMP-9的表達，從而減弱腫瘤細胞侵襲性[19]。Kim等[20]和Chen等[21]的研究表明MMP-9表達的增加是通過AKT活化NF-κB的轉錄活性介導的。本課題研究結果顯示，BCL6B可下調LoVo細胞中AKT磷酸化水平，且用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002處理細胞，能增加BCL6B引起的cyclin D1、MMP-9和p-AKT蛋白的下調趨勢，提示BCL6B對結直腸癌LoVo細胞的抑制作用涉及PI3K/AKT通路活性的降低。本結果為BCL6B對結直腸癌的影響及機制的研究提供了實驗依據，為我們下一步的研究提供了新的線索。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of BCL6B on proliferation and migration of human colorectal carcinoma LoVo cells and its potential mechanism

GU Yue, LI Ai-fang, SUN Hui, LI Xue-ru, ZHA He, ZHAO Jia-li, XIE Jia-qing, ZHOU Lan

(KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalDiagnosticsofMinistryofEducation,SchoolofLaboratoryMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:zhoulan0111@foxmail.com)

AIM: To detect the endogenous expression of B-cell leukemia/lymphoma 6 member B (BCL6B) in FHC and LoVo cells, and to investigate the effects of BCL6B on proliferation and migration of LoVo cells for further exploring the underlying mechanism. METHODS: The endogenous expression of BCL6B in the FHC and LoVo cells was detected by RT-PCR and Western blot. The methods of MTT assay, colony formation assay, wound healing assay and Transwell chamber experiment were employed to examine the biological functions of BCL6B in the LoVo cells. The mRNA and protein levels of BCL6B, cyclin D1 and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) were determined by RT-PCR and Western blot, respectively. The level of phosphorylated protein kinase B (p-AKT) was detected by Western blot. RESULTS: BCL6B expression was notably repressed in the LoVo cells as compared with the FHC cells, which were significantly increased by transfection with pcDNA3.1-BCL6B. The abilities of proliferation and migration of the LoVo cells at 72 h were inhibited by 28.33%(P<0.01) and 36.11%(P<0.05) in BCL6B group. The mRNA levels of cyclin D1 and MMP-9 in the cells of BCL6B group were decreased by 39.90%(P<0.01) and 77.36% (P<0.05), and the protein levels of cyclin D1, MMP-9 and p-AKT were reduced by 44.00%(P<0.05), 47.06%(P<0.01) and 32.88% (P<0.05), respectively. CONCLUSION: BCL6B inhibits proliferation and migration of the LoVo cells, and the PI3K/AKT signaling pathway is involved in this process.

BCL6B; Colorectal cancer; Cell proliferation; Cell migration; PI3K/AKT signaling pathway

1000- 4718(2017)01- 0038- 08

2016- 08- 30

2016- 10- 27

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.007

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