酵母菌高糖耐受機制的研究進展

畢新煜，劉功良，2*，姜弘佳，余潔瑜，卓燕穎，許琦祺，白衛東，2

（1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.廣州市廣式傳統食品加工與安全控制重點實驗室，廣東 廣州 510225）

酵母菌高糖耐受機制的研究進展

畢新煜1，劉功良1，2*，姜弘佳1，余潔瑜1，卓燕穎1，許琦祺1，白衛東1，2

（1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.廣州市廣式傳統食品加工與安全控制重點實驗室，廣東 廣州 510225）

在酒精濃醪發酵生產中，酵母菌在高糖度、高滲透壓等惡劣環境下發酵產生乙醇的性能與其耐受機制有密切的聯系。該文以酵母菌高糖耐受機制為切入點，介紹了耐高糖酵母菌的來源，高糖脅迫下酵母菌的應激反應，歸納已公開報道的與酵母菌高糖耐受機制可能有關的基因，借鑒真菌及細菌在轉錄組學與蛋白質組學水平上耐受性能及機制的研究，為基因水平上酵母菌高糖耐受機制的相關研究提供參考。

耐高糖酵母；耐受機制；基因；轉錄組學；蛋白質組學

近年來，在極端微生物的研究中，耐高糖酵母菌[1]已經引起了人們的廣泛關注。耐高糖酵母菌是能夠在高濃度糖的環境中生長、發酵并產生乙醇（C2H5OH）和二氧化碳（CO2）的真菌，對酒精濃醪發酵的工業的生產具有重要價值[2]。目前，國內外對耐高糖酵母菌的研究還處在菌種的馴化和選育、性能研究等階段[3]，對其高糖耐受機制的研究也在逐漸深入。耐高糖酵母菌的篩選是研究其高糖耐受機制的前提，酵母菌高糖耐受機制的研究目前僅僅是突破至分子水平，同時還存在一定的局限性，若能借助基因組、轉錄組和蛋白質組的相關技術及研究，將能夠深入地揭示或闡述其高糖耐受性的本質，這對酵母菌的定向改造以及酒精濃醪發酵具有重要意義[4-5]。

當前，酵母菌耐受高糖機制的研究主要包括高糖脅迫應激代謝產物、高糖脅迫的氧化應激、高糖耐受性能的基因三個方面[6]。酵母菌耐高糖機制研究大多限于分子水平，若能通過一株耐高糖酵母找出其與高糖耐受性能有關的基因，并對非耐高糖酵母進行定向改造，將會更有切合酒精濃醪發酵工業生產的需要，同時，也能簡化耐高糖酵母的篩選步驟，并進一步揭示酵母菌耐受高糖的本質[7]。

1 耐高糖酵母菌的來源

1.1 自然選育

自然選育是獲得耐高糖酵母的途徑之一，取材于自然，來源廣泛，在蜂巢、蜂蜜、甘蔗、高糖果酒、果汁等樣品中均有發現。從樣品中篩選較理想生產菌種的一般步驟：采集菌樣→富集培養→菌種分離→性能鑒定[8]。

杜鵑等[9-10]以東北椴樹蜜為原料，通過分離純化得到酵母菌，運用高糖平板分離培養基進行初篩，然后通過耐糖能力測試對酵母菌進行復篩，最終獲得酵母菌YMI-37，能在葡萄糖含量80%的高糖環境中生長，還具有起酵速度快、發酵能力強的特性。根據分子生物學的鑒定結果顯示為酵母菌屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

LIU G L等[11]從蜂蜜廠收集了17份陳舊蜂蜜樣品，通過富集培養、梯度平板稀釋及多次傳代，分離得到6株耐高糖酵母菌，經過26S rDNA基因測序分析鑒定均為酵母菌屬的蜂蜜接合酵母（Zygosaecharomyces mellis）。采用杜氏管發酵法測定各菌株的糖耐受性、酒精耐受性、酸耐受性，并進行高糖濃度條件下的酒精發酵實驗。結果顯示，6株菌的耐受糖濃度范圍為50%～70%，耐酒精度范圍為10%vol～12%vol，可耐受pH 2.5～4.5的酸性環境。其中菌株6-7431的抗逆性能最好，耐受的最高糖濃度為70%，耐受的最高酒精度為12%vol，耐受的最低pH值為2.5，篩選出的各菌株在高糖環境中均能發酵產生酒精。

1.2 誘變育種

在發酵工業中，誘變育種是選育大多數優良高產菌株使用的方法[12]。在人工誘變基因突變的基礎上進行的，是微生物育種的主要方法之一，現今的工業生產也是普遍使用。

趙碩等[13-14]采用馴化和紫外誘變的方法，以酵母菌株作為出發菌株，進行耐高糖酵母菌株的篩選，最終確定最佳紫外誘變條件為：15 W紫外燈，照射距離20 cm，照射時間40 s。在此條件下，成功篩選出2株在65%的高糖環境下仍能起酵的目的菌株。

2 高糖脅迫應激反應的研究

在高糖脅迫條件下酵母菌主要的應激代謝產物甘油和海藻糖的含量有所改變，同時細胞也會通過主動調節胞內物質的濃度和酶活力來適應這種高糖環境。

彭酈等[15]以鮮榨荔枝汁為原料，通過發酵培養基葡萄糖質量濃度的改變（180～400 g/L），考察釀酒酵母AWRI R2在高滲透壓環境中生長及胞內海藻糖代謝情況。結果顯示該釀酒酵母在300 g/L高葡萄糖質量濃度下能夠良好生長，胞內海藻糖的含量隨著初始糖濃度的增加而迅速增加，當葡萄糖質量濃度為400 g/L時，胞內海藻糖積累量達48.73 mg/g（濕質量）。李曉軍等[16]研究了釀酒酵母FCC2146在30%高糖環境下指數生長期的生理代謝，結果表明，甘油質量濃度較對照組提高了400%、海藻糖質量濃度和胞外酒精質量濃度分別提高11%和100%，釀酒酵母的主要相容性溶質為海藻糖[17]和甘油。

張穗生等[18]從甘蔗糖廠的廢棄物中篩選獲得一株野生型釀酒酵母MF1002，通過紫外突變獲得糖分利用能力較高的呼吸突變高產菌株MF11a。在葡萄糖含量為30%和40%的培養條件下，菌株MF1002生長和乙醇發酵受到明顯抑制，菌株MF11a的最大菌體數目、最高出芽率和乙醇發酵濃度等均顯著高于菌株MF1002。其中，在30%葡萄糖含量的脅迫培養條件下，菌株MF11a的胞內超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活力、胞內過氧化物酶活力、細胞質三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）活力和線粒體ATP酶活力的上升幅度顯著。表明這3種酶活力可能與菌株MF11a的高糖耐受能力有關，可作為該菌株進一步改造的指導指標。

3 與酵母菌高糖耐受機制可能有關的基因

酵母菌高糖耐受性能應該會受到某些基因的調控，但目前尚未有明確結論或突破性的進展。因此，可以從酵母菌代謝過程中的部分關鍵基因出發，進一步深入探討。

GPD2基因是工業釀酒酵母甘油合成途徑的關鍵基因，黃廣慶[19]通過構建缺失GPD2基因的單倍體和二倍體突變酵母菌，再與各自所對應的出發菌株的比較中發現，副產物中甘油和乙酸等的產量有所下降，同時乙醇的獲得率有明顯提高，但是菌株的生長狀況受到較大影響，葡萄糖的消耗速率變慢，發酵周期有所延長。張國英[20]以工業釀酒酵母（S.cerevisiae）Y為出發菌株，使用電擊轉化的方法獲得重組菌。利用酵母雙雜交技術，分別將兩種菌進行群體雜交，通過聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）的方法和產孢法，對全突變掉GPD1和GPD2基因的雙倍體菌株進行分別鑒定。以葡萄糖為底物的發酵實驗表明，兩種重組菌分別與對應的宿主菌比較，重組菌的生長速率比宿主菌緩慢，甘油產量較宿主菌明顯下降了，但酒精產量都顯著提高。發酵的次要副產物，丙酮酸和乙酸的產量都有所減少。

孟剛等[21]在乙酸代謝途徑中通過敲除具有乙酸激酶活性的tdc D基因控制乙酸溢流，通過糖含量的改變（“高糖”和“微糖”），探究乙酸含量的變化以及對發酵的影響。結果顯示，tdc D基因缺失菌能夠適應更靈活的殘糖控制范圍，在“高糖”控制條件下，tdc D基因缺失菌株在對數生長后期能夠保持較高的生長速率和產酸效率。乙酸產量為比對照菌降低了64.72%，色氨酸產量為比對照菌提高了54.88%。

陳小玲等[22]通過敲除野生型工業釀酒酵母MF1015菌株的Mbp1基因，分析二者在乙醇耐受性、耐熱性、細胞壁完整性、呼吸強度、海藻糖含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、過氧化物酶、乙醇脫氫酶活性等方面的差異。結果表明，在含剛果紅或十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的平板上突變菌株的菌落比野生型小、菌體存活率低；突變菌株的乙醇耐受性和耐熱性均下降，在乙醇體積分數為9%的液體培養基中，突變菌株的最大OD600nm值約為3.15，而野生型最大OD600nm值約為3.48；40℃時，突變菌株最大OD600nm約為3.0，而野生型約為4.5；用體積分數9%的乙醇處理后，突變菌株胞內海藻糖含量、過氧化物酶、SOD、過氧化氫酶、乙醇脫氫酶酶活分別比野生型低49%、80%、24%、37%、73%，而未經乙醇處理的突變菌株和野生型酶活無明顯差別。推測Mbp1基因有助于工業釀酒酵母適應外部不良環境。

4 酵母菌耐受高糖機制的轉錄組學和蛋白質組學研究

酵母的耐受性存在千絲萬縷的聯系，受到很多因素的綜合影響，是較復雜的調控系統[23]，通過對某個單一基因的敲除或者過表達來有效地提高酵母的耐受性不一定能得到很好的效果[24]。隨著基因組學、蛋白質組學等技術的發展，也可以從綜合和整體的角度來研究酵母菌的耐受性機制[25]。

彭素琴等[26]以一株產醬香地衣芽孢桿菌CGMCC3963和不產醬香的模式菌株ATCC14580為研究對象，測定其耐高滲、耐酸和耐乙醇的特征，利用轉錄組學研究分析菌株CGMCC3963的耐受機制。轉錄組比較分析表明，二者的一系列與耐受相關的基因表達有差異。乙醇脫氫酶、編碼Ⅱ類休克蛋白、氧化應激、pH動態平衡等相關基因的差異表達，在提高菌株耐受酸性環境能力上起了重要作用，Ⅱ類和Ⅲ類熱休克基因的高表達對菌株CGMCC3963耐乙醇能力起了決定性作用。

葉美玲[27]應用轉錄組測序技術對南極酵母AN5正常生長和銅離子處理條件下的轉錄組進行測序，將測序數據進行整理分析、篩選相關差異基因、對差異基因進行功能注釋和分析。利用定量聚合酶鏈反應（quantitativepolumerase chain reaction，qPCR）技術研究南極酵母AN5重金屬脅迫下基因的表達情況，從差異基因中篩選了3個基因進行驗證。在銅離子脅迫下，重復蛋白基因的表達量均有不同程度的上調，說明這兩個基因很可能與南極酵母AN5的重金屬抗性機制有關。

謝夢琴等[28]將正常組培養的魯氏接合酵母和高鹽培養的魯氏接合酵母，通過雙向電泳技術[29]分離樣品中的蛋白，通過生物信息軟件對電泳圖進行分析，實驗結果顯示，蛋白點差異＞1.5的點有63個，其中34個下調，29個上調，成功的找出其中蛋白點差異＞3的點有10個，從而分析高鹽環境對魯氏接合酵母的影響。

張雪[30]以石耳地衣真菌為研究對象，使用聚乙二醇對其進行干旱脅迫誘導后，提取蛋白，通過蛋白質雙向電泳及質譜技術結合的方法，在蛋白質組學水平上對石耳地衣真菌的抗旱分子機制進行了研究。然后通過對差異蛋白質組比較分析，共鑒定出136個在干旱脅迫下蛋白質豐度變化達到2倍以上的蛋白。通過數據庫查詢，對所鑒定出來的蛋白點的相對分子質量、等電點、細胞內定位以及蛋白功能等信息進行分析[31]。結果發現在聚乙二醇誘導脅迫下，蛋白豐度發生較大變化的蛋白主要是與線粒體、核糖體、分子伴侶等相關的蛋白，說明當石耳地衣處于干旱脅迫時，石耳地衣真菌能夠通過調節其能量代謝、蛋白質合成和折疊過程適應外界環境的變化[32]。

5 結論與展望

隨著分子生物學與基因工程的迅速發展[33]，基因組學、轉錄組學和蛋白質組學的相關技術與積累[34]，可為酵母菌高糖耐受機制的深入研究提供新的思路，相關工作可從以下三個方面開展：（1）單菌基因組測序與比較，通過生物信息軟件對耐高糖酵母菌與普通酵母菌序列中不同的部分進行基因功能注釋；（2）通過RNA-Seq高通量測序技術[35]，在RNA層次分析其高糖耐受機制；（3）在蛋白質的水平上分析其高糖耐受機制。

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Research progress on high sugar tolerance mechanism of yeast

B
I Xinyu1,LIU Gongliang1,2*,JIANG Hongjia1,YU Jieyu1,ZHUO Yanying1,XU Qiqi1,BAI Weidong1,2
(1.College of Light Industry and Food,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China;2.Key Laboratory of Traditional Cantonese Processing and Safely Control,Guangzhou 510225,China)

In the thick mash fermentation of alcohol production,the performance of yeast producing ethanol under the severe environment(such as high sugar,high osmotic pressure)and its tolerance mechanisms were closely connected.Based on sugar tolerance mechanism of yeast as the breakthrough point,the paper introduced the source of the high sugar tolerant yeast,the stress response of yeast under high sugar stress,the genes reported that may related to high sugar tolerance resistance were summarized.Taking the research of fungi and bacteria tolerance performance and mechanism in the transcriptomics and proteomics level as reference,it provided references for the study of high sugar tolerance mechanism of yeast on gene level.Key words：high sugar tolerant yeast;tolerance mechanism;gene;transcriptomics;proteomics

TS261.1

0254-5071（2017）10-0001-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.001

2017-07-18

廣東省高等學校優秀青年教師培養計劃項目（YQ2015094）；廣東省聯合培養研究生示范基地項目（粵教研函[2016]39號）；廣州市科技計劃項目（201509010005）；廣州市產學研協同創新重大專項（201604020001）；廣東省省級大學生創新創業訓練計劃項目（201711347039）；廣東省校級大學生創新創業訓練計劃項目（201711347123）

畢新煜（1993-），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：劉功良（1980-），男，副教授，博士，研究方向為發酵工程。