蘿卜硫素誘導(dǎo)肝癌Huh-6細(xì)胞增殖和凋亡

韓玉芳，趙延兵，李 俊，李 理，李勇敢

蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)是蔬菜中所發(fā)現(xiàn)的植物活性物質(zhì)，可增加正常細(xì)胞抵抗外來(lái)致癌物的能力，以達(dá)到抗癌作用[1]。蘿卜硫素通過(guò)對(duì)細(xì)胞癌變起始期階段的調(diào)控，促使癌細(xì)胞走向凋亡，抑制腫瘤血管形成和抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[2]。本研究就蘿卜硫素誘導(dǎo)肝癌Huh-6細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行探討，為研究蘿卜硫素治療肝癌提供思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料細(xì)胞：人源肝癌細(xì)胞Huh-6，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。藥品與試劑：蘿卜硫素純度99.8%，生產(chǎn)批號(hào)2016-02，購(gòu)于西安昊軒生物科技有限責(zé)任公司；四唑鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；鼠源β-actin及兔源Ki-67、MMP-2、Bax、Cleave Caspase-3、二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。儀器：550-酶標(biāo)儀，美國(guó)BIORAD公司。恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào)：3110)與超凈工作臺(tái)(型號(hào)：Heraguard ECO)，低溫離心機(jī)(型號(hào)：PICO 17)，美國(guó)Thermo公司；電泳儀(型號(hào)：DYC-Mini1)、電泳槽(型號(hào)：DYC-Mini1)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2MTT法檢測(cè)蘿卜硫素對(duì)Huh-6細(xì)胞存活率將對(duì)數(shù)期狀態(tài)良好的Huh-6細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔種于96孔板。細(xì)胞貼壁后吸去原培養(yǎng)液，然后加含不同濃度(2、5、10、20、30、50、70、100 μM)蘿卜硫素培養(yǎng)液200 μL。對(duì)照組只加DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)20 h時(shí)每孔加入5 mg· mL-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，移去原培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO并震蕩5 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=給藥組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.3AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)Huh-6細(xì)胞凋亡將對(duì)數(shù)期狀態(tài)良好的Huh-6細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔接種于6孔板。細(xì)胞貼壁后吸去原培養(yǎng)液，然后加含不同濃度(10、20、30 μM)蘿卜硫素培養(yǎng)液2 mL。對(duì)照組只加DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。按試劑盒說(shuō)明書收集細(xì)胞，然后加入FITC標(biāo)記的Annexin-V，再加入PI，避光反應(yīng)5 min后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4Transwell小室觀察Huh-6細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力Huh-6細(xì)胞分為對(duì)照組與蘿卜硫素(20 μM)組，取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室，下室一般加適量完全培養(yǎng)基，按試劑盒說(shuō)明書要求培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，吸去孔中培養(yǎng)液，按染色試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行染色，并于顯微鏡下觀察記數(shù)。

1.5免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ki-67與MMP-2表達(dá)細(xì)胞分組處理同上，對(duì)照組不加藥物。培養(yǎng)24 h后，預(yù)冷PBS漂洗3～5遍，采用4%中性多聚甲醛固定25～35 min，然后實(shí)驗(yàn)方法按免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作。

1.6Westernblot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)將細(xì)胞樣本進(jìn)行裂解，從而提取蛋白，并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳與轉(zhuǎn)膜，加一抗(兔源Bax、Cleave Caspase-3與β-actin，1∶1 200稀釋)，并于4 ℃環(huán)境下孵育超過(guò)6 h。隨后HPR標(biāo)記的二抗(1∶3 500)室溫孵育1 h，最后進(jìn)行X線片曝光、顯影、定影。

2 結(jié)果

2.1蘿卜硫素對(duì)Huh-6細(xì)胞增殖的抑制作用MTT檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組(100%)相比，不同濃度(0、2、5、10、20、30、50、70、100 μM)蘿卜硫素的處理Huh-6細(xì)胞24 h，呈濃度依賴性地降低Huh-6細(xì)胞的存活率，而增加抑制作用(P<0.05)；2 μM和5 μM 蘿卜硫素組Huh-6細(xì)胞存活率未降低(P>0.05)，見圖1。

①與對(duì)照組相比較，P<0.05。圖1 不同濃度蘿卜硫素對(duì)Huh-6細(xì)胞存活率的影響

2.2蘿卜硫素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC/PI結(jié)果顯示，經(jīng)(10、20、30 μM)蘿卜硫素處理后的Huh-6細(xì)胞，細(xì)胞存活率分別比對(duì)照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)果表明，蘿卜硫素可以誘導(dǎo)肝癌Huh-6細(xì)胞凋亡，見圖2。

①與對(duì)照組相比較，P<0.05。圖2 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)Huh-6細(xì)胞凋亡情況

2.3各組Huh-6細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力蘿卜硫素組Huh-6細(xì)胞經(jīng)蘿卜硫素(20 μM)處理后，與對(duì)照組相比，Huh-6細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力均下降，說(shuō)明蘿卜硫素可以抑制Huh-6細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移，見圖3。

圖3 Transwell小室觀察Huh-6細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力(結(jié)晶紫染色，×400)

2.4蘿卜硫素對(duì)Huh-6細(xì)胞Ki-67與MMP-2表達(dá)Ki-67表達(dá)于細(xì)胞核中，MMP-2表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，染色陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色。與對(duì)照組相比，蘿卜硫素組Huh-6細(xì)胞Ki-67與MMP-2的表達(dá)均減少，呈弱陽(yáng)性染色，且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，見圖4。

圖4 Huh-6細(xì)胞Ki-67與MMP-2表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×400)

2.5Bax與CleaveCaspase-3表達(dá)與對(duì)照組相比，肝癌Huh-6細(xì)胞經(jīng)蘿卜硫素處理后，Bax、Cleave Caspase-3蛋白水平增高，結(jié)果提示明蘿卜硫素可以激活Bax與Caspase-3介導(dǎo)的凋亡通路，從而誘導(dǎo)人肝癌Huh-6細(xì)胞死亡，見圖5。

A:Huh-6細(xì)胞蛋白表達(dá)；B:Hub-6細(xì)胞蛋白表達(dá)灰度值①與對(duì)照組比較，P<0.05。Bax：凋亡蛋白；Cleave Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，β-actin：內(nèi)參。圖5 肝癌Huh-6細(xì)胞Bax與Cleave Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素衍生物誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞S期阻滯、細(xì)胞活性氧產(chǎn)生增加，且較蘿卜硫素作用明顯；蘿卜硫素能調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，并可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)途徑誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和S期阻滯[8]。慢性阻塞性肺氣腫患者的外周血巨噬細(xì)胞Toll樣受體(TLR4)、髓樣分化因子88(My D88)高表達(dá)，而蘿卜硫素可以降低TLR4、My D88高表達(dá)，從而減輕慢阻肺患者的炎癥反應(yīng)[9-10]。朱海鵬[11]觀察了蘿卜硫素對(duì)人前列腺癌LNCa P細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響以及IGFBP-3及NF-κB在此過(guò)程中的變化，發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素對(duì)LNCaP細(xì)胞的抑制作用可能與IGFBP-3有關(guān)，有研究顯示后者可能是通過(guò)改變NF-κB的表達(dá)發(fā)揮作用[12]。

蘿卜硫素處理Huh-6細(xì)胞24 h，呈濃度依賴性地降低Huh-6細(xì)胞的存活率，蘿卜硫素處理后的Huh-6細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率明顯增加。同時(shí)，蘿卜硫素可以促進(jìn)Bax表達(dá)，使Caspase-3裂解為發(fā)揮功能片段Cleave Caspase-3，從而介導(dǎo)肝癌Huh-6細(xì)胞凋亡。Caspase引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞死亡過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其激活主要包括線粒體依賴途徑和死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13-15]。Bax通過(guò)與Bcl-2B形成同源或異源二聚體來(lái)促使細(xì)胞走向死亡[16-18]，此時(shí)，Bax可與Bcl-2B形成異源二聚體時(shí)則抑制細(xì)胞凋亡[19-22]。另一方面，肝癌Huh-6細(xì)胞經(jīng)蘿卜硫素處理后，細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力均下降，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果提示，蘿卜硫素可以抑制肝癌細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)鍵蛋白Ki-67與MMP-2的表達(dá)，使得細(xì)胞增殖能力減小，且細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力下降，進(jìn)一步促進(jìn)蘿卜硫素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。

總之，本研究顯示蘿卜硫素可誘導(dǎo)肝癌Huh-6細(xì)胞增殖和凋亡，抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力。

[1] 王見冬,袁其朋,錢忠明.蘿卜硫素研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(2):76-80.

[2] 李小冬,郭貝貝,楊英士,等.蘿卜硫素抗癌機(jī)理研究進(jìn)展[J].中藥材,2015,38(8):1768-1771.

[3] 任杰,蔣何菲,趙娟,等.蘿卜硫素及其衍生物BSFN通過(guò)激活PI3K/Akt途徑誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2014,49(20):1813-1819.

[9] 邱貞琴,張華.蘿卜硫素對(duì)慢阻肺患者TLR4、MyD88以及下游炎性因子的影響分析[J].臨床肺科雜志,2016,21(3):407-411.

[10]曾曉麗,劉曉菊,包海榮,等.蘿卜硫素對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者巨噬細(xì)胞Toll樣受體4/髓樣分化因子88信號(hào)通路的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2014,37(4):250-254.

[11]朱海鵬.蘿卜硫素對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖、周期、凋亡及IGFBP-3、NF-κB表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,61(6):801-804.

[12]楊高祥,周妍,田華,等. N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素通過(guò)上調(diào)Bak和下調(diào)Bcl-2B蛋白表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(4):311-314.

[13]秦尤文,王椿.針對(duì)凋亡抑制蛋白家族(Caspase抑制物)的腫瘤治療新策略[J]. 世界臨床藥物, 2006,27(5):274-277.

[14]Mitupatum T,Aree K,Kittisenachai S,et al mRNA expression of Bax, Bcl-2B,p53,Cathepsin B, Caspase-3 and Caspase-9 in the HepG2 cell line following induction by a novel monoclonal Ab Hep88 mAb:cross-talk for paraptosis and apoptosis[J].Asian Pac J Cancer Prev,2016,17(2):703-712.

[15]Erfani S,Khaksari M,Oryan S,et al.Nampt/PBEF/visfatin exerts neuroprotective effects against ischemia/reperfusion injury via modulation of Bax/Bcl-2B ratio and prevention of Caspase-3 activation[J].J Mol Neurosci,2015,56(1):237-243.

[16]靳雅玲,歐士鈺,羅偉生.Bcl-2B、Bax與肝纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2013,20(1):124-126.

[17]Jin Y,Fan JT,Gu XL,et al.Neuroprotective activity of cerebrosides from typhonium giganteum by regulating Caspase-3 and Bax/Bcl-2B signaling pathways in PC12 cells[J].J Nat Prod,2017,80(6):1734-1741.

[18]Zhang S,Qin F,Yang L,et al.Nucleophosmin mutations induce chemosensitivity in THP-1 leukemia cells by suppressing NF-kappaB activity and regulating Bax/Bcl-2B expression[J].J Cancer,2016,7(15):2270-2279.

[19]王衛(wèi)東,陳正堂.Bcl-2B/Bax比率與細(xì)胞“命運(yùn)”[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2007,14(4):393-396.

[20]Sitarek P,Skala E,Toma M,et al.A preliminary study of apoptosis induction in glioma cells via alteration of the Bax/Bcl-2B-p53 axis by transformed and non-transformed root extracts of Leonurus sibiricus L[J].Tumour Biol,2016,37(7):8753-8764.

[21]Peng X,Chen K,Chen J,et al.Aflatoxin B1 affects apoptosis and expression of Bax,Bcl-2B,and Caspase-3 in thymus and bursa of fabricius in broiler chickens[J].Environ Toxicol,2016,31(9):1113-1120.

[22]Xu G,Kuang G,Jiang W,et al. Polydatin promotes apoptosis through upregulation the ratio of Bax/Bcl-2B and inhibits proliferation by attenuating the beta-catenin signaling in human osteosarcoma cells[J].Am J Transl Res,2016,8(2):922-931.