UPLC-MS/MS法檢測黃草烏中毒人體肝臟中的主要生物堿成分

李繼印，洪仕君，黃舒柏清，劉青青，任國印，李樹華

草烏為毛茛科烏頭屬植物，主要分為北草烏和黃草烏兩種。云南烏頭屬(Aconitum)植物資源豐富，有66種[1-2]，主要以黃草烏或滇南草烏為基源植物[3]，多分布于滇西及滇中部；其主要成分為滇烏堿、粗莖烏頭堿甲、塔拉薩敏等[4]，因產地不同、種屬間生物堿的含量差別較大[5]。黃草烏塊根具有舒筋活絡、祛風除濕、消腫止痛的功效，民間廣泛用于治療風濕和跌打損傷等病癥[6]，但黃草烏毒性較強，安全范圍窄，中毒案件頻繁發生。由于對黃草烏的認識不充分，法醫學實踐中對草烏中毒案件的鑒定主要關注烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的檢測。對黃草烏中毒案(事)件中毒性成分的檢測報道較少，未見測定人體生物檢材中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的文獻報道。因此，本研究建立的粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的UPLC-MS/MS檢測方法對黃草烏中藥物成分分析及法醫學鑒定均具有應用價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏標準品(成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98.0%)；8-去乙酰基滇烏堿對照品(云南中醫學院馬曉霞提供，純度為94.5%)；乙腈和甲醇(色譜純)，甲酸和乙醚(分析純)，pH 9.2硼酸鹽緩沖溶液，娃哈哈純凈水等。

1.1.2儀器UPLC-MS/MS三重四極桿串聯質譜儀(Agilent1290型液相色譜儀和AB SCIEX 4000Q TRAP串聯質譜儀)，電子天平(賽多利斯BT125D)，臺式高速離心機(Thermo Mx120)。

1.1.3檢驗材料公安機關送檢的檢材：疑為黃草烏中毒死者肝臟組織及現場提取的黃草烏(經云南中醫學院楊耀文副教授鑒定證實為黃草烏)干燥塊根5 g。

1.2方法

1.2.1色譜質譜條件UPLC條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈-0.1%甲酸(含5 mmoL乙酸銨)水溶液，梯度洗脫(0～0.5 min，乙腈體積分數為5%；0.5～5.0 min，乙腈體積分數5%→95%；5.0～5.5 min，乙腈體積分數為95%；5.5～5.6 min，乙腈體積分數95%→5%；5.6～7.5 min，乙腈體積分數5%)；流速0.5 mL·min-1，柱溫35 ℃，進樣體積5 μL。Mass條件：電噴霧離子源，正離子模式，三重四極桿檢測器，MRM檢測模式；粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的監測離子對及錐孔電壓、碰撞電壓等參數見表1。

表1 待測物的監測離子對和電壓參數 V

1.2.2標準貯備液的配制分別精密稱取10.0 mg粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏標準品于10 mL容量瓶內，用甲醇溶解定容至刻度線，振搖均勻后分別得到1.0 mg·mL-1粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的標準貯備液，置4 ℃冰箱保存。

1.2.3樣品處理黃草烏的處理：稱取送檢黃草烏干燥塊根2 g，粉碎后用甲醇浸泡5 d，得到20 mL浸泡液。取適量黃草烏浸泡液，經甲醇稀釋1 000倍后，離心(10 000 r·min-1)3 min，上清液經有機濾膜(13 mm×0.22 μm)過濾后得到黃草烏樣品。肝組織的處理：準確稱取1 g肝組織，勻漿后，用硼酸鹽緩沖液(pH為9.2)浸泡60 min，離心(15 000 r·min-1)3 min，上清液經乙醚萃取后氮氣吹干，甲醇定容至1 mL，經有機濾膜(13 mm×0.22 μm)過濾，得到送檢肝組織樣品。

2 結果

2.1方法適用性驗證在1.2.1分析條件下，分別對空白人體肝組織對照樣品、粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的混合標準溶液及送檢肝組織樣品和黃草烏樣品進行檢測；各以目標物對照品的兩對離子對和保留時間對送檢肝組織樣品和黃草烏樣品中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏進行定性分析。結果顯示：空白對照無干擾，方法專屬性好(見圖1)。

圖1 樣品中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的MRM圖

2.2線性范圍和檢出限取空白人體肝組織，按“1.2.3”方法處理后，用粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的混標溶液配制質量濃度分別為1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列基質加標溶液，并配制質量

濃度分別為1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列混標溶液，按“1.2.1”分析條件測定，以定量離子對的積分峰面積(A)對質量濃度(C，ng·mL-1)進行線性回歸(表2)。取線性最低點溶液逐級稀釋后測定，檢出限以信噪比(S/N)﹥3作為評價標準，定量限以信噪比﹥10為評價標準，粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的線性方程(線性范圍1～100 ng·mL-1)及檢出限見表2。

2.3精密度、回收率及穩定性配制低、中、高3個濃度的空白人體肝臟添加樣品(n=6)，按“1.2.3”方法處理樣品，在“1.2.1”節條件下測定，記錄粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的定量離子對的峰面積As，計算日內精密度；連續測定3 d，計算日間精密度；取空白肝臟組織，按“1.2.3”方法處理樣品后，配制成低、中、高3個濃度的基質加標溶液(n=6)，在“1.2.1”條件下測定，記錄峰面積為Am；另取上述3個濃度的混標溶液直接進樣，記錄峰面積為Astd。以As/Am計算提取回收率，Am/Astd計算基質效應，結果見表3。配制低、中、高3個濃度的肝臟質控樣品(n=6)，在室溫放置24 h及3次凍融循環后，按“1.2.3”方法處理樣品，在“1.2.1”條件下測定，計算精密度，考察其短期穩定性和凍融穩定性。結果表明，粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的RSD%均低于5.0%，說明樣品在上述條件下穩定。

表2 粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的線性方程及檢出限(n=6)

表3 待測物的精密度、基質效應和提取回收率

2.4樣品測定將“1.2.3”處理得到的送檢肝組織樣品和黃草烏樣品，在“1.2.1”條件下測定，送檢肝組織樣品中定性檢出粗莖烏頭堿甲和滇烏堿，未檢出塔拉薩敏和8-去乙酰基滇烏堿；其中粗莖烏頭堿甲的含量為54.25 ng·g-1，滇烏堿的含量為125.0 ng·g-1。送檢黃草烏塊根中定性檢出粗莖烏頭堿甲、滇烏堿、塔拉薩敏和8-去乙酰基滇烏堿，其中粗莖烏頭堿甲的含量為0.16 mg·g-1，滇烏堿的含量為0.43 mg·g-1，塔拉薩敏的含量為0.52 mg·g-1。

3 討論

目前，用HPLC[8]或LC/MS[9-10]法測定草烏中的烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的報道較多，對黃草烏及黃草烏中毒案件生物檢材中的主要毒性成分的檢測報道鮮見，赫偉等[11]采用HPLC法測定長喙烏頭中的滇烏堿、草烏甲素和黑烏弱堿；張盼盼等[12]用LC-MS/MS法檢測了尿液中滇烏堿、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿成分；劉偉等[13]用LC-MS/MS法檢測了血液中的草烏甲素、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿；李繼印等[5]用UPLC-MS/MS法檢測了云南5種不同產地的黃草烏中滇烏堿、粗莖烏頭堿甲和塔拉薩敏的含量；未見檢測黃草烏中毒人體生物檢材中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的報道。本文建立的UPLC-MS/MS檢測人體肝臟中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的方法，經驗證同樣適用于8-去乙酰基滇烏堿、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的檢測。本研究也對死者肝臟組織和對照檢材黃草烏塊根進行了烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的檢測，均未檢出這3種生物堿成分，進一步驗證了本案涉及的草烏塊根為黃草烏。此外，從案件涉及的黃草烏塊根中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的含量可以看出：3種成分相比，塔拉薩敏的含量最高，而中毒尸體肝臟組織中卻未檢出塔拉薩敏成分，原因可能是塔拉薩敏化學性質不如滇烏堿和粗莖烏頭堿甲穩定，或者塔拉薩敏在體內代謝較快。因此，涉及黃草烏中毒案件的檢驗鑒定應優先考慮滇烏堿和粗莖烏頭堿甲的檢驗。

本文建立的方法適用于各類檢材中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的分析檢測，本研究為黃草烏中毒案件的法醫學鑒定提供更多的檢測目標物，為案(事)件的死亡原因分析及定性判定提供更多的依據。

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