四川泡菜中產(chǎn)γ-氨基丁酸微生物的系統(tǒng)發(fā)育與表達能力評估

曾 林，劉 波，許小艷，張 慶,*，楊 穎，盧倩文，趙婷婷，唐 潔

四川泡菜中產(chǎn)γ-氨基丁酸微生物的系統(tǒng)發(fā)育與表達能力評估

曾 林1,2，劉 波1，許小艷1，張 慶1,2,*，楊 穎3，盧倩文1,2，趙婷婷1,2，唐 潔1

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點實驗室，四川 成都 610039；2.西華大學(xué)古法發(fā)酵（釀造）生物技術(shù)研究所，四川 成都 610039；3.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101）

為拓展產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）微生物資源，以四川泡菜為分離源，從中分離產(chǎn)GABA的乳酸菌和酵母，并對其GABA表達能力進行評估。通過分離純化，從四川泡菜中獲得了338 株乳酸菌和67 株酵母。采用紙色譜測定，篩選獲得12 株乳酸菌和3 株酵母菌具有產(chǎn)GABA的能力。生理生化和系統(tǒng)發(fā)育研究揭示12 株乳酸菌分別被鑒定為Lactobacillus acidophilus（占比8.3%）、Lactobacillus fermentum（8.3%）、Lactobacillus kimchii（8.3%）、Lactobacillus suebicus（8.3%）、Lactobacillus brevis（16.7%）、Lactobacillus parafarraginis（8.3%）、Lactobacillus similis（8.3%）、Lactobacillus plantarum（25.2%）和Lactobacillus pentosus（8.3%）；3 株酵母中，2 株被鑒定為Saccharomyces cerevisiae；1 株被鑒定為Candida tanzawaensis。進一步采用高效液相色譜對菌株GABA的表達能力評估發(fā)現(xiàn)，乳酸菌Lactobacillus plantarum BC114和Lactobacillus brevis BC237發(fā)酵產(chǎn)GABA的能力較強，分別達1 720 mg/L和1 080 mg/L；酵母菌Saccharomyces cerevisiae JM037發(fā)酵產(chǎn)GABA的能力較強，達670 mg/L。

γ-氨基丁酸；四川泡菜；微生物；系統(tǒng)發(fā)育；表達能力

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）是由谷氨酸脫羧生成的一種非蛋白質(zhì)類氨基酸，廣泛存在于微生物、植物和動物中[1-3]。在脊椎動物中，GABA以一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[4-5]，具有降低血壓、利尿、增強記憶等多種生理功能[6-8]。目前，獲得GABA的方法主要有化學(xué)合成、植物富集法和微生物發(fā)酵法三大類[9]。相比而言，化學(xué)合成GABA法反應(yīng)條件復(fù)雜、污染大；植物富集法產(chǎn)GABA難度大、含量低；而微生物發(fā)酵法產(chǎn)GABA條件溫和、安全性好[10]，成為了目前GABA生產(chǎn)的理想方法。然而，優(yōu)良菌株的缺乏制約了GABA發(fā)酵法的進一步發(fā)展。因此，如何獲取優(yōu)良菌株成為了開發(fā)GABA微生物發(fā)酵法的重要任務(wù)。

四川泡菜風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富，具有開胃、健脾、預(yù)防高血壓等保健功效，是一種深受消費者喜愛的傳統(tǒng)蔬菜發(fā)酵食品[11]。在已有報道中，田偉等[12]利用16S rRNA分析傳統(tǒng)四川發(fā)酵泡菜中的細(xì)菌多樣性，Lactobacillus屬占88.4%；張先琴等[13]利用變性梯度凝膠電泳分析四川泡菜中微生物的多樣性，細(xì)菌中Lactobacillus為優(yōu)勢菌種，真菌中主要為季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）和奧默柯達酵母（Kodamaea ohmeri）的近緣種。這些結(jié)果揭示了四川泡菜中主要微生物為乳酸菌和酵母菌，但只關(guān)注了四川泡菜中的益生菌對泡菜營養(yǎng)價值的影響，而對其代謝產(chǎn)物在泡菜中的功能性未關(guān)注。乳酸菌和酵母是發(fā)酵食品中重要的發(fā)酵劑，且其中的谷氨酸脫羧酶活性高，具有發(fā)酵生產(chǎn)GABA能力[14]。徐冬云等[15]從土壤、泡菜、酸奶等樣品中分離篩選的一株嗜酸乳酸菌，發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度達463 mg/L；Diana等[16]從西班牙奶酪中分離的L. brevis CECT8183，產(chǎn)GABA質(zhì)量濃度為100 mg/L；但以四川泡菜為源，對產(chǎn)GABA微生物進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與表達能力的評估尚未報道。

本實驗以四川泡菜為原料，對分離、篩選產(chǎn)GABA的微生物進行生理生化實驗及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對微生物發(fā)酵產(chǎn)GABA的能力進行評估。以期為篩選高產(chǎn)GABA微生物、拓寬產(chǎn)GABA菌種資源提供有效依據(jù)，而且對功能性四川泡菜的開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡菜液 四川新繁食品有限公司。

L-谷氨酸鈉（L-monosodium glutamate，L-MSG，含量≥98.5%） 成都市科龍化工試劑廠；GABA（含量≥99%） 上海金穗生物科技有限公司；丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS-Cl），含量≥98%） 成都華夏化學(xué)試劑有限公司；其他試劑為分析純級試劑。

培養(yǎng)基：MRS肉湯和改良MRS瓊脂培養(yǎng)基（含0.75 g/100 mL的CaCO3）均按文獻[17]配制，馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

Heraues Multifuge X1R冷凍高速離心機 美國Thermo Fisher公司；BHC-1300ⅡA2生物安全柜蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國耶拿分析儀器有限公司；2695型HPLC儀（配有2998紫外檢測器）美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物的分離純化

取泡菜樣液25 mL，加入225 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)5 min。取適量均質(zhì)液用無菌生理鹽水10 倍梯度稀釋后涂布于改良MRS培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基進行分離，于改良MRS培養(yǎng)基中37 ℃條件下倒置培養(yǎng)48 h，于PDA培養(yǎng)基中28 ℃條件下培養(yǎng)72 h。分別挑取單菌落劃線純化3 次。

1.3.2 產(chǎn)GABA微生物的初篩

采用紙色譜定性分析法初篩產(chǎn)GABA微生物。展開劑組分為正丁醇-冰乙酸-水（5∶3∶2，V/V），再添加1.2 g/100 mL茚三酮。以L-MSG標(biāo)品溶液（5 g/L）和GABA標(biāo)品溶液（5 g/L）為對照，吸取2 μL發(fā)酵液，在濾紙上逐個點樣，并編號。再將濾紙在30 ℃恒溫條件下展開，展開后將濾紙放入70 ℃烘箱中顯色10 min[18]。

1.3.3 生化特征分析

按照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[19]和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗方法》[20]中的鑒定方法進行。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)X i a n g W e n l i a n g等[21]的方法提取細(xì)菌D N A。1 6 S r R N A擴增引物為E u 2 7 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

根據(jù)李可[22]的方法提取真菌DNA。18S rRNA擴增引物：18S-F（5’-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’）和18S-R（5’-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3’）。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸55 s，36 個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

擴增產(chǎn)物連接到pGM-T載體后克隆入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α中，提取重組質(zhì)粒并對16S rRNA和18S rRNA測序。所得序列提交至NCBI進行BLAST比對，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 GABA發(fā)酵液的制備

紙色譜法初篩得到的產(chǎn)GABA乳酸菌菌株，將其接種到MRS肉湯（含10 g/L L-MSG）中30 ℃條件下靜置發(fā)酵48 h，將真菌菌株接種到PDA培養(yǎng)基（含10 g/L L-MSG），28 ℃、120 r/min發(fā)酵72 h。發(fā)酵液于8 000 r/min條件下離心5 min，取上清液，備用。

1.3.6 GABA表達能力評估

利用HPLC對上述菌株產(chǎn)GABA能力進行評估。參照張術(shù)聰[23]的方法對發(fā)酵液中GABA進行柱前衍生。HPLC分析條件：色譜柱為島津-GL INERTSIL ODS-3（4.6 mm×150 mm，5 μm）；紫外檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相A為甲醇，流動相B為醋酸鈉（pH 6.2）-甲醇-四氫呋喃（420∶75∶5，V/V）；流速1 mL/min；梯度洗脫時，流動相B比例為：0～6 min，80%～50%；6～9 min，50%～20%；9～10 min，20%～0%；10～11 min，維持0%；11～15 min，返回80%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

圖1 菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology

從傳統(tǒng)四川泡菜樣品中共篩選出338 株乳酸菌菌株，67 株真菌菌株。乳酸菌菌落形態(tài)（圖1A）多數(shù)是圓形或橢圓形，表面光滑，直徑多數(shù)在1～2 mm。顯微鏡觀察乳酸菌菌體形態(tài)為桿狀或短桿狀，革蘭氏染色陽性。真菌菌落形態(tài)（圖1B）菌落多為乳白色，表面光滑、濕潤、黏稠、容易挑起，質(zhì)地均勻，直徑多數(shù)為2～5 mm。

2.2 產(chǎn)GABA微生物的初篩結(jié)果

圖2 菌株發(fā)酵液紙色譜圖Fig. 2 Chromatography of the fermentation broths of 15 GABA-producing strains

由圖2可知，根據(jù)茚三酮顯色反應(yīng)的顏色深度初步判斷，利用紙層析方法從獲得的338 株乳酸菌和67 株真菌中篩選出12 株乳酸菌和3 株真菌，且發(fā)酵底物中L-MSG消耗明顯。真菌JM037和乳酸菌BC114發(fā)酵液中GABA含量較高。

2.3 菌株的生理生化及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

圖3 基于乳酸菌16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on their 16S rRNA gene sequences

圖4 基于酵母菌18S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of yeast based on their 18S rRNA gene sequence s

對篩選出的15 株產(chǎn)GABA菌株進行生理生化實驗，結(jié)果見表1。將產(chǎn)GABA的15 株菌株全部進行測序，測得序列經(jīng)Mallard 1.02軟件檢測后，再通過BioEdit 7.0軟件檢測，無異常序列。Stackbrandt等[24]認(rèn)為細(xì)菌16S rRNA序列同源性不低于97%可以認(rèn)為是一個種（真菌序列比對目前無明確判斷標(biāo)準(zhǔn)，參照細(xì)菌16S rRNA序列比對標(biāo)準(zhǔn)）。因此，15 株菌株分別被鑒定為Lactobacillus acidophilus（1 株）、Lactobacillus fermentum（1 株）、Lactobacillus malefermentans（1 株）、Lactobacillus suebicus（1 株）、Lactobacillus brevis（2 株）、Lactobacillus kimchii（1 株）、Lactobacillus similis（1 株）、Lactobacillus plantarum（3 株）、Lactobacillus pentosus（1 株）、Saccharomyces cerevisiae（2 株）、Candida tanzawaensis（1 株）。這與生理生化實驗中糖和醇的利用結(jié)果相符。

為了更明確顯示各菌株的分類學(xué)地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，選取相似菌株和代表菌株序列，用MEGA 5.0軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3、4。乳酸菌菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中基本分為8 個分支：1）菌株BC120、BC203、BC114和BC002與L. pentosus和L. plantarum聚為一個分支，其中BC120與L. pentosus相似度為100%，BC203、BC114、BC002與L. plantarum的相似度為100%；2）菌株BC200與L. similis聚為一個分支，相似度為99%；3）BC201與L. kimchii聚為一個分支，相似度為99%；4）BC186和BC237與L. brevis聚為一個分支，相似度為100%；5）BC202與L. suebicus聚為一個分支，相似度為100%；6）BC019與L. malefermentans聚為一個分支，相似度為99%；7）BC110與L. fermentum聚為一個分支，相似度為99%；8）BC112與L. acidophilus聚為一個分支，相似度為99%。圖4顯示了所篩選的3 株真菌的分類學(xué)地位，JM009和JM037與S. cerevisiae聚為一分支，相似度為100%；JM024與C. tanzawaensis聚為一分支，相似度為99%。

表1 生理生化實驗結(jié)果Table1 Results of physiological and biochemical tests

2.4 GABA表達能力評估

圖5 菌株發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度Fig. 5 GABA concentrations in the fermentation supernatants of the 15 isolates

利用HPLC對菌株產(chǎn)GABA能力進行評估。其標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝9×106X－18 007（R2＝0.999 2），可用于菌株發(fā)酵液中的GABA定量分析。15 株菌株GABA高效液相定量結(jié)果如圖5所示。菌株發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度為280～1 720 mg/L，其中乳酸菌中菌株BC114（L. plantarum）和菌株BC237（L. brevis）發(fā)酵產(chǎn)GABA質(zhì)量濃度較高，分別達1 720 mg/L和1 080 mg/L。周青等[25]從泡菜中篩選到一株植物乳桿菌，發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度達1 261 mg/L，并通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基成分，發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量提高了79%。因此，菌株BC114發(fā)酵生產(chǎn)GABA更具有優(yōu)勢，下一步可對其進行發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，提高該菌株產(chǎn)GABA的能力。真菌中菌株JM037（S. cerevisiae）發(fā)酵產(chǎn)GABA質(zhì)量濃度最高，達670 mg/L，是在四川泡菜中首次分離篩到具有產(chǎn)GABA能力的釀酒酵母菌株，可進一步通過酒精發(fā)酵能力實驗探討其在功能性果酒釀造中的應(yīng)用。

3 結(jié) 論

從傳統(tǒng)四川泡菜中分離篩選出338 株乳酸菌、67 株真菌，利用紙色譜分析法初篩得到具有產(chǎn)GABA能力的12 株乳酸菌和3 株真菌。經(jīng)鑒定12 株乳酸菌為Lactobacillus屬，分別被鑒定為L. acidophilus（占比8.3%）、L. fermentum（8.3%）、L. kimchii（8.3%）、L. suebicus（8.3%）、L. brevis（16.7%）、L. parafarraginis（8.3%）、L. similis（8.3%）、L. plantarum（25.2%）和L. pentosus（8.3%），3 株真菌中2 株為S. cerevisiae、1 株為C. tanzawaensis。并對其GABA表達能力進行了評估，結(jié)果顯示，菌株發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度為280～1 720 mg/L。其中，菌株BC114（L. plantarum）發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度高達1 720 mg/L。該研究結(jié)果不僅擴寬了產(chǎn)GABA菌株資源，為高產(chǎn)GABA微生物的篩選提供有效依據(jù)，而且對指導(dǎo)富含GABA功能性泡菜的生產(chǎn)具有重要的理論和實踐意義。

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Phylogeny and Performance Assessment of γ-Aminobutyric Acid-Producing Microorganisms from Sichuan Pickles

ZENG Lin1,2, LIU Bo1, XU Xiaoyan1, ZHANG Qing1,2,*, YANG Ying3, LU Qianwen1,2, ZHAO Tingting1,2, TANG Jie1
(1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, College of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Biotechnology Institute of Ancient Brewing, Xihua University, Chengdu 610039, China; 3. Shandong Institute for Food and Drug, Jinan 250101, China)

In order to broaden and evaluate microbial resources for producing γ-aminobutyric acid (GABA), lactic acid bacteria and yeast strains with the ability to produce GABA were isolated, screened and identif ed from Sichuan pickles. A total of 338 strains of lactic acid bacteria and 67 strains of yeast were initially isolated from Sichuan pickles. Further, 12 strains of lactic acid bacteria (LAB) and 3 strains of yeast which could produce GABA were screened out by paper chromatography. Then the 12 LAB strains were identif ed as Lactobacillus acidophilus (8.3%), Lactobacillus fermentum (8.3%), Lactobacillus kimchii (8.3%), Lactobacillus suebicus (8.3%), Lactobacillus longer (16.7%), Lactobacillus parafarraginis (8.3%), Lactobacillus similis (8.3%), Lactobacillus plantarum (25.2%) and Lactobacillus pentosus (8.3%), while the 3 yeast strains were identif ed as two strains of Saccharomyces cerevisiae and one strain of Candida tanzawaensis using physiological and biochemical tests and phylogenetic analysis. The GABA-producing ability of these selected strains was further assessed by high-performance liquid chromatography (HPLC). Our results indicated that Lactobacillus plantarum BC114, Lactobacillus brevis BC237 and Saccharomyces cerevisiae JM037 showed higher GABA-producing capability, and the cultured broth supernatants contained 1 720, 1 080 and 670 mg/L GABA, respectively.

γ-aminobutyric acid; Sichuan pickles; microorganism; phylogeny; performance assessment

10.7506/spkx1002-6630-201702014

TQ920.6

A

1002-6630（2017）02-0087-05

2016-03-01

教育部春暉計劃項目（Z2014060）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項目（2016JY0253）；四川省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201510623081）；西華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項目（YCJJ2016048）

曾林（1992—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物技術(shù)。E-mail：18202837933@163.com

*通信作者：張慶（1979—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物技術(shù)。E-mail：biozhangq@163.com

曾林, 劉波, 許小艷, 等. 四川泡菜中產(chǎn)γ-氨基丁酸微生物的系統(tǒng)發(fā)育與表達能力評估[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 87-91.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702014. http://www.spkx.net.cn

ZENG Lin, LIU Bo, XU Xiaoyan, et al. Phylogeny and performance assessment of γ-aminobutyric acid-producing microorganisms from Sichuan pickles[J]. Food Science, 2017, 38(2): 87-91. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702014. http://www.spkx.net.cn