腦缺血再灌注大鼠局灶性腦缺血預處理后Nogo-A及NgR的表達

焦義明 何健玲 何勝男

(鄭州大學第二附屬醫院體檢中心，河南 鄭州 450014)

腦缺血再灌注大鼠局灶性腦缺血預處理后Nogo-A及NgR的表達

焦義明 何健玲 何勝男1

(鄭州大學第二附屬醫院體檢中心，河南 鄭州 450014)

目的 觀察局灶性腦缺血預處理干預后大鼠腦內Nogo-A、NgR表達的情況。方法 建立腦缺血再灌注及預處理模型，將健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組和缺血預處理組，每組又分為1、2、7 d 3個亞組，預處理時間為10 min，免疫組化法檢測大鼠缺血海馬區Nogo-A、NgR的表達，RT-PCR方法檢測大鼠缺血海馬區NgR mRNA的表達。結果 與假手術組比較，缺血再灌注組在1、2、7 d 3個時間點Nogo-A及NgR表達均增高；腦缺血預處理干預后，Nogo-A及NgR在各個時間點的表達較缺血再灌注組均明顯降低(P<0.05)。結論 局灶性腦缺血預處理的干預可以降低大鼠腦內Nogo-A及NgR的表達而提高腦缺血耐受的神經保護作用。

局灶性腦缺血預處理；Nogo-A；NgR

給予一次或多次非致死量的腦缺血預預處理能夠誘導腦缺血耐受，從而可以減輕腦缺血再灌注引起的腦損傷。隨著對這一作用認識的加深，其分子保護機制被提出許多種。但其通過何種具體的機制發揮作用，目前仍然不清楚〔1〕。Nogo-A是一種重要的神經生長抑制因子，其作用是抑制神經元的再生，而腦缺血后功能損傷程度則與神經元再生的難易存在一定關系。由此表明，腦缺血后功能損傷輕重一定程度上取決于Nogo-A的作用。NgR是Nogo-A的受體，而Nogo-A 往往通過與之結合來發揮作用。為此，本實驗擬通過制備腦缺血預處理模型，觀察腦組織中Nogo-A、NgR表達的情況，來探討腦缺血耐受的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組 成年健康雄性SD大鼠，體重(250±30)g，由河南省實驗動物中心提供，隨機分為3組，假手術組；缺血再灌注組：假手術3 d后給予2 h大腦中動脈栓塞(MCAO)，再分別灌注1、2、7 d 3個時間點后處死；缺血預處理組：缺血預處理10 min再灌注3 d后給予2 h MCAO，再灌注1 d、2 d及7 d 3個時間點后處死。

1.2 缺血預處理及模型制作 本實驗參照Longa等〔2〕線栓法并加以改進進行。在腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，采取頸正中部切口，鈍性依次分離右側頸總、頸外、頸內動脈，將右側頸外動脈結扎并切斷，在殘端距分叉約5 mm處，剪一切口，插入約0.26 mm直徑的釣魚線，沿頸內動脈輕柔推進距分叉處約19 mm遇有輕微阻力即行，結扎頸外動脈殘端，10 min后抽出釣魚線至分叉處，形成第一次再灌注，縫合切口，完成腦缺血預處理。3 d后再次用同樣方法造成MCAO 2 h，各組分別再灌注1 d、2 d、7 d后檢測大鼠神經功能情況，然后處死取出腦組織用于指標測定。假手術組僅分離右側頸總動脈及分叉處，不插入線栓阻斷MCAO。動物蘇醒后爬行時向左劃圈，提尾時左前肢內收屈曲為模型制備成功的標志，術中用白熾燈使大鼠肛溫保持在37℃左右。

1.3 神經功能缺損評分 采用Longa等〔2〕的神經功能標準評分：無任何神經功能障礙為0分；不能伸展左側前肢為1分；向左側劃圈為2分；向左側傾倒為3分；無自主活動且伴有意識障礙為4分。

1.4 免疫組化分別檢測大鼠大腦缺血海馬區Nogo-A 和NgR的表達 每個亞組大鼠處死后斷頭取腦，固定、石蠟包埋后切片，取前鹵后6 mm部分進行連續性冠狀切片，片厚5 μm，分別按Nogo-A和NgR的免疫組化說明書依次進行染色、 DAB顯色、封片，光鏡下觀察細胞質內呈棕色者為Nogo-A和NgR陽性細胞。每張切片分別選取10個具有代表性的高倍視野，平均計算Nogo-A和NgR陽性細胞數。

1.5 RT-PCR檢測大鼠缺血海馬區NgR mRNA的表達 每個亞組在右側腦缺血組織區取100 g研磨粉碎，加入1.4 ml Trizol 試劑勻漿，經過分離、沉淀、洗滌、溶解后即可提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA 質量，用Transgene 公司提供的RT試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，用 NgR上游引物(5'CAGTGACTTAGAGGGTTGTGCT3')及下游引物(5'CCATTGCCTGGTGGAGTGT3')建立PCR 反應體系，擴增DNA長度為210 bp；然后對產物DNA進行電泳，用D-140 圖像記錄系統對目的條帶分析，以NgR 的DNA 條帶和內參GPADH(上游引物5'CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT3'，下游引物5'AGGGGCCATCCACAGTCTTC3'，擴增片段595 bp)的DNA 條帶灰度值比值計算目的基因NgR mRNA的表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗及多因素方差分析。

2 結 果

2.1 神經功能缺損評分 假手術組在各個時間點均無神經功能缺損，缺血再灌注組均有不同程度的神經功能缺損，而缺血預處理組神經功能評分在各時間點均明顯低于缺血再灌注組(P<0.05)。見表1。

2.2 免疫組化方法檢測大鼠右側海馬區Nogo-A表達 缺血再灌注組在右側海馬區可見較多的胞質染色深的Nogo-A陽性細胞，與假手術組相應時間點比較差異顯著(P<0.05)；實施預處理干預后，右側海馬區Nogo-A陽性細胞數有所降低，與缺血再灌注組比較差異顯著(P<0.05)。見表2。

2.3 免疫組化方法檢測大鼠右側海馬區NgR表達 缺血再灌注組右側海馬區可見有較多的胞質染色深的NgR陽性細胞，與假手術組相應時間點比較差異顯著(P<0.05)；實施預處理干預后，右側海馬區 NgR陽性細胞有所降低，與缺血再灌注組相應時間點比較差異顯著(P<0.05)。見表3。

2.4 RT-PCR檢測大鼠右側海馬區NgR mRNA表達 缺血再灌注組右側海馬區可見有較多的NgR mRNA表達，與假手術組相應時間點比較差異顯著(P<0.05)；實施預處理干預后，右側海馬區NgR mRNA表達有所降低，與缺血再灌注組相應時間點比較差異顯著(P<0.05)。見表4。

表1 各組神經功能缺損評分的比較±s,n=10)

與假手術組比較：1)P<0.05；與缺血再灌注組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組右側海馬區Nogo-A表達的比較

表3 各組右側海馬區NgR表達的比較

表4 各組右側海馬區NgR mRNA表達的比較

3 討 論

缺血預處理后的腦組織可對隨后發生的缺血產生保護性的耐受現象〔3〕。腦缺血耐受的保護機制是一個復雜的多機制參與的過程，包括細胞因子的參與、興奮性和抑制性神經遞質動態平衡的改變等，但其具體的內源性保護機制仍不明確。Moncayo等〔4〕對2 492例腦梗死患者研究發現，發生過短暫性腦缺血(TIA)的腦梗死患者預后較好，未發生過TIA的患者預后較差，且神經功能缺損較重。由此可知，TIA一定程度上類似于腦缺血預處理，因而研究腦缺血預處理的分子保護機制又具有一定的臨床意義。有研究表明，缺血10 min作為預處理，再灌注3 d后產生的腦保護作用最強，且時間持續約為7 d〔5〕。因此，本實驗設計采用缺血10 min作為預處理時間，3 d作為再灌注時間，同時設置了1 d、2 d、7 d 3個時間點，其符合預處理腦保護作用的持續時間。

本實驗發現，局灶性腦缺血預處理可通過降低Nogo-A的表達來起到神經保護作用。也有研究證實，應用Nogo-A抗體IN-1可使腦缺血損傷后的神經元軸突生長和功能恢復〔6〕。由此可見，腦缺血損傷后的受損程度和功能恢復情況與Nogo-A有很大關系。本文結果推測Nogo-A與NgR相結合來發揮腦損傷作用，而至于二者如何結合的，還有待進一步研究。通過腦缺血預處理后，二者表達較缺血再灌注組而言均降低，大鼠的神經功能評分也是降低的，因此我們進一步推測腦缺血預處理可能通過降低Nogo-A與NgR的表達這一途徑來提高腦缺血耐受的，從而對腦缺血損傷起保護作用。這對缺血性腦血管疾病的防治作用具有一定的臨床意義。

1 Durukan K,Tatlisumak T.Preconditioning-induced ischemic tolerance:a window into endogenous gearing for cerebroprotection〔J〕.Exp Transl Stroke Med,2010;2(1):2．

2 Longa EI,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery:occlusion without craniotomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

3 Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium〔J〕.Circulation,1986;74(5):1124-36．

4 Moncayo J,de Freitas GR,Bogousslaky J,etal.Do transient ischemic attacks have a neural protective effect〔J〕?Neurology,2000;54(11):2089-90.

5 Zhou C,Li Y,Nanda A,etal.HBO suppresses Nogo-A,NgR,or RhoA expression in the cerebral cortex after global ischemia〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2003;309(2):368-76.

6 趙 紅,高曉玉,王得新.腦缺血再灌注模型大鼠神經生長抑制因子Nogo-A的表達變化〔J〕.中風與神經疾病雜志,2009;26(1):4-7.

〔2015-08-12修回〕

(編輯 曹夢園)

焦義明(1984-)，男，碩士，醫師，主要從事腦血管疾病的基礎研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)02-0299-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.017

1 河南中醫藥大學肝膽脾胃二科