PI3K/Akt信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞中的表達(dá)及意義

涂江江　董翠梅　陶利英　劉秀麗　康馬飛

【摘要】 目的：研究PI3K/Akt信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞中的表達(dá)及意義。方法：收集筆者所在醫(yī)院普外科胃癌切除術(shù)患者胃癌組織標(biāo)本，應(yīng)用腫瘤球懸浮分選法從組織標(biāo)本中分選出胃癌干細(xì)胞和普通腫瘤細(xì)胞。比較兩組細(xì)胞中PI3K、Akt的蛋白及mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌干細(xì)胞組的PI3K及Akt的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.680±0.122和0.513±0.121，明顯高于普通胃癌細(xì)胞組的0.235±0.086和0.205±0.069，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌干細(xì)胞組的PI3K及Akt的蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.771±0.206和0.601±0.182，明顯高于普通胃癌細(xì)胞組的0.215±0.012和0.218±0.028，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：PI3K/Akt信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞中存在高表達(dá)的現(xiàn)象，表明該通路極有可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 胃癌； 干細(xì)胞； PI3K； Akt

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.2.084 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2017）02-0154-02

胃癌屬于普外科常見(jiàn)的惡性腫瘤，源于胃黏膜上皮細(xì)胞[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤是一種信號(hào)通路疾病。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)胞信號(hào)通路，因此抑制該信號(hào)通路成為胃癌靶點(diǎn)治療和預(yù)防轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵[2-3]。但目前PI3K/Akt信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞中的表達(dá)研究罕見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)收集胃癌切除術(shù)患者胃癌組織標(biāo)本，應(yīng)用腫瘤球懸浮分選法從組織標(biāo)本中分選出胃癌干細(xì)胞和普通腫瘤細(xì)胞，比較兩組細(xì)胞PI3K、Akt的蛋白及mRNA表達(dá)量，以期能夠?yàn)槲赴┑念A(yù)防和治療提供新的依據(jù)和策略，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集筆者所在醫(yī)院普外科胃癌切除術(shù)患者胃癌組織標(biāo)本40例。患者年齡為28～53歲，平均（39.5±6.1）歲，所有患者均為首次確診，均未接受過(guò)放療或化療，無(wú)其他腫瘤病史，無(wú)內(nèi)分泌疾病。CD44、PI3K、Akt抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。小鼠抗人GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

胃癌干細(xì)胞的原代培養(yǎng)、分化及鑒定：應(yīng)用腫瘤球懸浮分選法分選組織標(biāo)本中胃癌干細(xì)胞。具體方法為，先用常規(guī)方法對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行脫蠟水化，使用微波爐對(duì)組織進(jìn)行抗原修復(fù)，將組織中的壞死組織和血管剔除干凈，清洗標(biāo)本（D-Hanks液）。將組織標(biāo)本剪碎，再將其消化（胰酶），終止消化后，在離心機(jī)中離心，棄上清，將細(xì)胞收集、重懸，在其中加入超微磁珠（CD44陽(yáng)性包被），充分混勻后，將分離株安裝于磁場(chǎng)之上，將分選獲得的細(xì)胞置于含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、白血病抑制因子及b27的干細(xì)胞培養(yǎng)基中。培養(yǎng)箱的參數(shù)設(shè)置為：37 ℃，5% CO2，飽和濕度。使用CD44+對(duì)胃癌干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，使用免疫熒光染色對(duì)胃癌干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性表達(dá)即可以認(rèn)為其為胃癌干細(xì)胞，染色結(jié)果為陰性表達(dá)則為普通胃癌細(xì)胞。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞PI3K、Akt基因的mRNA表達(dá)水平

兩組細(xì)胞的總RNA使用Trizol法提取，內(nèi)參對(duì)照為GAPDH，（PI3K、Akt及GAPDH引物均由蘇州金唯智生物科技公司合成）。對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR擴(kuò)增，熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司，7500型。選用20 μl為擴(kuò)增體系，試驗(yàn)反應(yīng)條件：95 ℃、5 min循環(huán)1次；95 ℃、20 s，60 ℃、40 s，循環(huán)40次；以0.5 ℃從65 ℃逐漸遞增至95 ℃。按照2-△△CT計(jì)算Notch1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.4 Western blot檢測(cè)兩組PI3K、Akt的蛋白表達(dá)

收集兩組細(xì)胞，使用常規(guī)方法提取總蛋白，儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中。取總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴下以80 V電壓轉(zhuǎn)至PVDF膜，時(shí)間為1.5 h。PBST緩沖液洗膜3次后，封閉1.5 h。剪膜后加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，兔抗人PI3K抗體、兔抗人Akt抗體的稀釋比例均為1∶1000。第2天進(jìn)行復(fù)溫，使用PBST搖擺清洗3次后，加入二抗，室內(nèi)溫度條件下孵育60 min。條帶結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行收集，量化分析用Image J軟件進(jìn)行處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞PI3K、Akt基因的mRNA表達(dá)水平

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌干細(xì)胞組的PI3K及Akt的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.680±0.122和0.513±0.121，明顯高于普通胃癌細(xì)胞組的0.235±0.086和0.205±0.069，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 Western blot檢測(cè)兩組PI3K、Akt的蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌干細(xì)胞組的PI3K及Akt的蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.771±0.206和0.601±0.182，明顯高于普通胃癌細(xì)胞組的0.215±0.012和0.218±0.028，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)兩組PI3K、Akt的蛋白表達(dá)

3 討論

胃干細(xì)胞是具有自我更新、無(wú)限增殖、定向分化能力的細(xì)胞。一旦胃干細(xì)胞的基因發(fā)生突變或者微環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)增殖不受調(diào)控的干細(xì)胞，向腫瘤干細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變，引起胃癌的發(fā)生[4]。PI3K信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展上起著重要的調(diào)節(jié)作用，具有抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用[5]。在乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤等多種人類腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)有PI3K信號(hào)通路的異常活化[6-8]。

對(duì)PI3K信號(hào)通路進(jìn)行深入研究，對(duì)胃癌的診斷及治療有著深遠(yuǎn)的意義[9-11]。早期胃癌、中晚期胃癌中PI3K蛋白和Akt蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均較正常胃黏膜組織高，表明PI3K、Akt與胃癌的形成和惡性進(jìn)展有關(guān)，可能主要通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡起作用。程玉等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K活性可誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。PI3K/Akt通路在胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移、侵襲表達(dá)方面都具有重要的作用[14]。本課題組推測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞中可能存在異常表達(dá)。本次研究中，通過(guò)腫瘤球懸浮分選法分選組織標(biāo)本中的胃癌干細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定均呈陽(yáng)性表達(dá)CD44。通過(guò)與普通胃癌細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌干細(xì)胞組的PI3K及Akt的mRNA相對(duì)表達(dá)量為分別為0.680±0.122和0.513±0.121，明顯高于普通胃癌細(xì)胞組的0.235±0.086和0.205±0.069，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌干細(xì)胞組的PI3K及Akt的蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.771±0.206和0.601±0.182，明顯高于普通胃癌細(xì)胞組的0.215±0.012和0.218±0.028，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明PI3K/Akt信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞中異常激活，可能參與胃癌的發(fā)生與發(fā)展，但在PI3K/Akt信號(hào)通路如何調(diào)控胃癌干細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移上還尚不清楚，需下一步著重探討研究。

綜上所述，PI3k/Akt信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞中高表達(dá)，表明它可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。

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（收稿日期：2016-09-04）