多組織陽性對照蠟塊的制作及應用

馬曉菁

摘要：目的 建立多組織對照，使免疫組化染色陽性對照獲取更方便，結果更可靠。方法 選擇正常的闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟組織制作成石蠟塊，然后選擇4～6 mm直徑的空心管在組織塊上打孔，分別包埋于一個蠟塊中建立多組織對照蠟塊。預先切取對照片干燥后保存備用，常規免疫組化染色。結果 染色后不同組織呈不同分布或表達，且對照組織中至少有一個組織顯示陽性。結論 此多組織對照蠟塊可用于常見的多種抗體的對照，相比于不設置對照，結果更可靠；相比于單組織對照和組織芯片，也更為方便實用。

關鍵詞：免疫組化；質量控制；陽性對照；多組織對照

根據免疫組化技術的特點，在染色過程中設立對照是進行染色質量控制的重要措施之一，Dr.Hector Battifora首次提出免疫組化的多組織對照的概念，經過多次改良和優化，形成多組織對照蠟塊（Multi-tissue control blocks）[1-4]。經過多次嘗試單組織陽性對照蠟塊、組織芯片和多組織對照蠟塊，發現多組織對照蠟塊具有結果可靠、使用方便等優點。現將最常用的闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟組織制作成多組織對照蠟塊，下文將詳細介紹制作過程和陽性對照設計。

1 資料與方法

1.1材料 選取本科室手術標本中的正常闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟組織進行常規的取材，脫水浸蠟和包埋制成蠟塊。

1.2多組織對照蠟塊的制作 選取4～6 mm直徑的空心管在已經制作好的蠟塊上打孔，存放于離心管里備用。然后將上述四類組織組織按順序放入預熱的蠟塊模具，組織面朝下緊貼并黏附于模具，使四塊組織位于同一平面，然后灌注蠟，加上塑料包埋盒，再將模具置于加熱臺上，使組織與蠟融合，最后置于冷卻臺，冷卻后取出蠟塊即可。

1.3多組織對照蠟塊的使用 蠟塊制作完成后按常規連續切片，厚度3～4 μm，裱貼于正離子玻片靠近標簽的一端，干燥后可以疊放在一起，需要時隨時取用。若需長時間保存可烤片后放入4℃冰箱。常規免疫組化染色時，就將檢測組織裱在對照組織的旁邊，然后同時進行烤片、脫蠟以及免疫組化染色。

1.4免疫組化染色方法 選用全自動的Ventana Benchmark XT免疫組化染色儀，整張玻片都能覆蓋，也可用于手工染色，同時滴加抗體。

1.5陽性結果的判斷和設計 介紹部分廣泛使用的抗體在闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟中的表達，見表1。

2 結果

陽性對照染色理想，不同抗體在不同組織中具有不同的染色強度和定位，即使同一組織也有強弱不同的表達，體現了組織抗原含量的變化，且四個位點至少有一個位點呈現陽性反應，其余組織則可作為陰性對照。且由于是在同一張玻片上染色，便于讀片醫生可以做出更為可靠的判斷。

3 討論

3.1單組織陽性對照蠟塊制作簡單，雖然組織獲取方便，但由于標記覆蓋面不夠廣，往往需要準備大量用于各種標記類型的組織蠟塊，且單組織陽性對照蠟塊通常是使用已知抗原表達較強的組織，相對于抗原表達較弱的檢測組織就容易產生假陰性的結果。且陽性對照的設置必須考慮免疫組化染色的檢測下限（1ow limitofdetection，LLOD）[7]，LLOD是指在已知的可低表達某一抗原蛋白的組織或細胞成分中觀察的陽性反應，所以多組織蠟塊可以很好的避免判斷為假陰性的風險。所以位于紐約羅切斯特大學醫學中心的生物染色委員會（The biological Stain commission.University of Rochester Medical Center， Rochester，NY）和很多專家建議使用低表達的對照組織以保證染色系統足夠的靈敏度檢測低抗原水平的組織和減少假陰性結果產生的風險[8-10]。當然，最理想的是使用細胞蠟塊和多肽類陽性對照，但前期成本昂貴，制作繁瑣[11]，可以作為下一步研究的方向。多組織對照標記覆蓋面廣，闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟四種組織的對照能覆蓋100余種抗體，且取材也非常方便。同一種抗體在不同的組織中有不同的表達，以此可以減少假陽性的風險。

3.2雖然組織芯片抗體覆蓋面最廣，且高通量的特點也使檢測的準確性更高，同時更為節約組織[12-13]，但組織芯片操作太過繁瑣，對制作過程要求高，包埋容易形成空泡，且由于組織量太小，細胞數量少，大量連續切片陽性率不穩定，同一平面經常無法切全，而如果使用專業設備制作組織芯片又加大了工作成本，不利于日常操作。多組織對照蠟塊克服了組織芯片組織量太少的不足，操作成本及便利性提高，按常規制作包埋就可取得理想的效果。

3.3多組織對照蠟塊一般選擇四個對照組織，兼顧抗體覆蓋面和實際操作，更為方便。可以對大量標記進行檢測，組織獲取方便，制作工具和方法也十分簡便，且與待檢組織于同張玻片上同時檢測，達到了實驗條件的一致性，保證了實驗結果的準確性和科學性，多組織蠟塊可以很好的避免判斷為假陰性的風險。同時也較好地達到了對免疫組化進行質控的目的。

3.4根據抗體表達強度的差異，如 CD34在骨髓造血干細胞得表達量很大，而對于皮膚腫瘤來說，僅隆突性皮膚纖維肉瘤可表現 CD34強陽性染色，而在其他類型的皮膚腫瘤中 CD34表達較弱。因此可根據該類疾病的特點，設計專門用于一類疾病的多組織蠟塊，該方法可對疾病的診斷和分類有較大的指導意義。此外對于需要定量分析的抗體，如臨床上 HER-2免疫組化染色，多組織陽性對照能提供能代表“0-3+”染色結果的信息使其判讀更為精確標準。

參考文獻：

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編輯/翟辰萬