人子宮內膜異位癥纖維化動物模型的建立

路攀++++++米雪++++++苗勁蔚++++++吳迪

[摘要] 目的 采用子宮內膜異位癥患者的子宮內膜組織建立纖維化裸鼠模型。 方法 收集子宮內膜異位癥患者的子宮內膜組織（增殖期及分泌期），使用開腹方法將所取子宮內膜組織種植入BALB/c裸鼠盆腹腔。觀察裸鼠子宮內膜病灶生長以及裸鼠生存情況，分別于種植后的第7、14天開腹探查，觀察異位病灶的位置、大小及與周圍組織的關系，并取部分組織進行病理驗證。 結果 人子宮內膜異位癥裸鼠模型成功建立，裸鼠腹部表面可見隆起的結節，質韌，與周圍組織粘連，活動度差，開腹探查可見異位病灶大部分位于腹壁及膀胱旁，病理證實異位病灶可見子宮內膜樣腺體結構，周圍有基質細胞及大量炎癥細胞浸潤，可見纖維組織沉積。 結論 子宮內膜異位癥患者的子宮內膜種植于裸鼠盆腹腔內，可成功建立異體子宮內膜異位癥纖維化裸鼠模型，為其發生、發展機制及其惡性生物學行為的研究提供平臺。

[關鍵詞] 子宮內膜異位癥；不孕；盆腔疼痛；盆腔包塊；動物模型

[中圖分類號] R711.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（b）-0008-04

[Abstract] Objective To establish a fibrotic nude mouse model of human endometriosis by taking advantage of endometrial patients. Methods Stage proliferation and secretion of endometrial tissues in patients diagnosed as endometriosis were collected， thus a minilapamtomy was performed to transplant fresh human endometrial pieces into the peritoneum of BALB/c nude mice. The growth of endometrial disease lesion and survival situation in nude mice. The mice were killed at 7 and 14 d after transplantation to observe the location and size of the ectopic lesion and its relationship with the surrounding tissue. Part of the tissues were examined by histopathology. Results The human endometriosis model was successfully established， in which we could saw toughening lumps burged on the abdomen surface of nude mice， with the surrounding tissue adhesion， and mobility was poor. The most endometrial lesions located in nape and nexted to bladder were observed by through exploratory laparotomy. Pathology confirmed that endometrial glandular structure was surrounded by stromal cells and inflammatory cells infiltration， and it had fibrous tissue deposition in ectopic lesions. Conclusion A nude mouse model of endometriosis has been successfully established. It may provide an appropriate model for research of the mechanism of endometriosis.

[Key words] Endometriosis； Infertility； Pelvic pain； Pelvic cyst； Animal model

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是指子宮內膜腺體和基質異位到宮腔以外的部分，以卵巢、子宮直腸陷凹、子宮骶韌帶等部位最常見，是婦科一種慢性的、良性的、雌激素依賴性的疾病，主要影響6%～10%的育齡期女性[1]，其病理學基礎為異位的子宮內膜組織在雌激素的作用下周期性剝脫，這種異位內膜周期性出血被其周圍組織包裹并發生纖維化，形成異位結節，占據正常卵巢組織并形成盆腔粘連[2]，從而導致慢性盆腔疼痛、不孕、月經異常和痛經等一系列癥狀，其中盆腔疼痛率高達45%～82%[3]，不孕率高達50%[4]，嚴重影響廣大女性的生活質量。

然而EMs產生的具體機制尚不明確。目前有關EMs的機制主要有以下6種學說：異位種植學說、體腔上皮化生學說、誘導學說、遺傳因素、免疫與炎癥因素、其他因素，但均不能完全解釋EMs的發病、進展及預后問題，而且就目前診治原則看來，手術及藥物治療雖有一定療效，但是復發率仍然較高[5-6]。據文獻統計，術后1年的復發率為8%～10%，術后2年的復發率約20% [7]，術后5年復發率高達36%～57%[8]。而且手術治療可造成有功能的卵巢組織減少，懷孕概率也明顯降低[9]；內分泌藥物由于其嚴重的不良反應而不能長期使用。EMs導致盆腔組織纖維化，是造成女性盆腔疼痛、不孕的主要原因，因此成功構建出EMs的動物模型，將從分子層面揭示EMs纖維化的機制，為將來發現更有效的診治方式提供很大幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇BALB/c雌性裸鼠20只[合格證號：scxk（京）2014-0004]，6～8周齡，體重17～21 g，由中國醫學科學院腫瘤醫院動物實驗室提供無菌環境飼養（溫度22～24℃，濕度：45%～70%，12 h白天，12 h黑夜），分5籠飼養（每4只裸鼠放入1籠中），采用SPF級條件飼養。本動物實驗遵循北京市所制訂的有關實驗動物保護和使用指南，并經首都醫科大學附屬北京婦產醫院（以下簡稱“我院”）實驗動物倫理委員會批準。

1.2 標本來源

所用子宮內膜均來自就診于首都醫科大學附屬北京婦產醫院因EMs行卵巢囊腫剔除術的5名患者，平均年齡為（35±4）歲，無生育要求，術前6個月內未經任何激素治療，且均月經周期規律，無子宮內膜相關疾病。行腹腔鏡手術切除卵巢子宮內膜異位囊腫的同時，麻醉下采用診刮的方式獲得子宮內膜（即嚴格消毒外陰、陰道及宮頸口，減少污染，刮取子宮內膜1～2 g），刮出后立即放入含4 mL DMEM培養液無菌瓶中。同時留取部分內膜組織用福爾馬林浸泡，所有病例術后病理提示為3名患者子宮內膜為增殖期，2名患者子宮內膜為分泌期。該研究方案經過我院倫理委員會批準，并根據倫理學要求，所有患者均簽署相關知情同意書。

1.3 標本處理

子宮內膜組織離體后立即置入含4 mL DMEM培養液無菌瓶后，冰盒低溫運輸，快速送于實驗室進行接種（接種時間應在離體后1 h內，否則影響接種成功率）。接種前標本用冷的0.1 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去血塊和黏液。沖洗至少三遍，然后于無菌培養皿內用無菌組織剪將沖洗好的子宮內膜組織剪成2 mm×3 mm～3 mm×3 mm碎塊，每8～10小塊為一組，分別置入PBS中，準備接種。

1.4 模型建立

裸鼠采用腹腔注射麻醉，質量分數為0.5%的戊巴比妥15～18 ml/kg。麻醉后固定，取下腹正中橫切口長約1 cm，將上述處理的人子宮內膜碎塊8～10塊隨機置入盆腹腔不同部位，采用無菌針縫合切口。每份子宮內膜種植4只裸鼠（經病理證實為增殖期的子宮內膜組織種植于12只裸鼠盆腹腔，編號為1～12；分泌期子宮內膜組織種植于8只裸鼠盆腹腔，編號為13～20），待裸鼠麻醉清醒后，置于溫度22～26℃，相對濕度50%～60%、無菌凈化屏障系統內飼養。當日起給予裸鼠雌激素（苯甲酸雌二醇30 μg/kg，1次/3 d，腿部肌內注射）。術后3 d，每日腹腔注射青霉素鈉100 μL/（只·次）（內含200 000 U青霉素鈉）預防感染。根據文獻造模成功的標志：肉眼可見種植呈隆起透明的結節狀、囊狀，移植物被結締組織覆蓋，并有血管形成，病理提示為子宮內膜樣組織，見內膜樣基質和腺上皮結構[10]。

1.5 觀察與取材

每日觀察裸鼠活動情況及裸鼠腹部結節的變化，包括大小、位置、質地、與腹壁的關系及與周圍組織的關系，并分別于種植后的第7、14天開腹探查，0.5%的戊巴比妥15～18 mL/kg麻醉下，采用下腹正中切口，大小約2 cm，打開裸鼠盆腹腔，觀察盆腹腔內病灶的生長情況，包括位置、大小、數目及其與周圍臟器的關系、顏色、周圍血管生成情況，各自取材部分病灶標本，分別放入10%福爾馬林溶液中浸泡，常規石蠟包埋，分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化，顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 種植成功率

經大體分析和病理分析，所有裸鼠模型均種植成功，即建模成功率為100%。

2.2 大體分析

種植后約7 d，部分移植內膜可從裸鼠腹部肉眼可見，移植物有增大，可呈隆起的小包狀的透明結節或囊腫（圖1）。分別于種植后的第7、14天打開裸鼠的盆腹腔，觀察病灶，發現病灶以腹壁生長為主（55%），切口處常見，另膀胱旁（45%）、腸管附近（15%）可見小塊病灶。種植第7天可見移植內膜與裸鼠組織牢固黏附，形成異位結節，質韌，病灶邊緣血管生成明顯，裸鼠病灶與周圍組織輕度粘連，尚能分離（圖2）。種植第14天可見移植病灶變硬，與裸鼠組織連接致密，難以分離（圖2）。

2.3 顯微鏡下分析

在光鏡下可見子宮內膜樣腺體增生，腺上皮細胞增生活躍，散在間質細胞，類似于子宮內膜樣腺上皮及基質圍繞囊泡生長；腺體細胞呈立方形或扁平狀，腺體邊緣較多炎性細胞（如淋巴細胞、巨噬細胞等）浸潤（圖3）。采用DAPI做熒光染料，在熒光顯微鏡下觀察免疫組化的結果，可見EMs內膜組織中纖維化相關蛋白如CTGF、α-SMA、Collagen Ⅰ等表達明顯增加（圖4）。

3 討論

EMs是一種常見的婦科良性疾病，發病率逐年上升，主要影響生育期女性[11-13]。就目前而言，導致EMs患者盆腔疼痛和不孕的發病機制比較復雜，涉及免疫、激素、基因和環境等因素[14]，分子生物學專家認為纖維化是導致盆腔疼痛及不孕的關鍵。與其他疾病一樣，對于EMs纖維化發生、發展的動態研究以及探索有效的診斷策略，動物模型是理想的研究對象。本實驗采用裸鼠所建的人EMs模型中，病理顯示原有組織的形態及生化特征，實驗結果臨床觀察意義較大，可作為探索EMs纖維化的發病機制及有效診治策略的理想模型。

構建EMs動物模型的動物選擇，現主要采用的動物包括靈長類動物、大鼠、裸鼠等[10，14-15]。但是靈長類動物比較珍貴，且受到倫理學的限制而不能被用來科學研究[1]；大鼠、兔子有自身的免疫功能，可以經過自體內膜移植，但是其內膜與人的內膜在種屬及生化方面存在很大差異，因此此類動物所見模型存在諸多局限[16-17]。然而因為裸鼠屬于免疫缺陷小鼠，不會發生異種異體移植免疫排斥反應，種植后成活率較高，模型構建成功率較大，可重復性好，因此裸鼠模型比較常用。而且實驗中發現裸鼠模型中成功生成的子宮內膜異位病灶與人類的子宮內膜異位病灶相似度高，可觀察性強，因此使用裸鼠是研究EMs的很好選擇。

目前EMs裸鼠模型的構建方法主要有自體移植、皮下直接種植人類子宮內膜組織法、皮內注射EMs組織碎片法、腹腔內直接種植人類子宮內膜組織法、腹腔內注射EMs細胞系法等[18-20]。由于裸鼠本身的子宮體積較小，取裸鼠的子宮內膜需要嫻熟的實驗技能及精確剝離子宮內膜的方法，可操作性較差；而皮下種植不符合EMs的好發特點；子宮內膜細胞系價格昂貴，種植入腹腔內彌散性高易被吸收，而且用人的子宮內膜可以使具有物種特異性的藥物被開發，從而利于人EMs的質量。我們此次構建EMs裸鼠模型即采用的是腹腔內直接種植人子宮內膜組織的方法，這樣更加符合EMs在人體中的發病特點，結果建模成功率為100%，并經病理學金標準證實。

但是實驗過程中發現，在腹腔種植子宮內膜病灶存在一定的局限性：①不容易觀察，由于種植于腹腔，隨小腸的蠕動，種植的病灶也會移動，以至在觀察時不易定位。②不易測量，因為種植位置較深，雖然有部分的病灶會突出皮膚表面，可觀察到明顯的結節狀組織塊，但是其向腹腔內延伸的大小不能明確，要測量其大小則需開腹，而裸鼠本身就免疫能力低下，容易感染，因此多次開腹可能影響裸鼠的存活能力，并增加感染機會；另外有部分種植的病灶明顯突向腹腔，表面無法觀察，不能確定模型種植是否成功，必須開腹探查。③給藥的問題，對于皮下或腹腔給藥無明顯不足，但是若病灶給藥則會出現問題，原因是對裸鼠表面結節塊不明顯的裸鼠，難以定位種植的病灶。

內膜組織來源的選擇各有不同，采用正常的增殖期內膜者，認為增殖期的內膜種植成功率較高；采用正常的分泌期內膜者認為分泌期內膜種植更符合經血逆流學說[21]。而本實驗中所采取的內膜組織既有增殖期內膜又有分泌期內膜，最終都種植成功，裸鼠體健且裸鼠表面均可見結節狀組織塊，質韌，并通過病理切片證實為子宮內膜組織。因此，在動物模型的建立過程中，所采取的內膜并無特殊要求。

從本次實驗過程及結果來看，模型的建立比較成功，且最后經病理證實為子宮內膜組織，同時我們發現種植的子宮內膜異位病灶與周圍組織明顯粘連，免疫組化證明與纖維化關系密切，因此該動物模型可以用來研究纖維化在人EMs發生、發展及惡性生物學行為中的作用具有很大的臨床價值。

另外，因為上述提到腹腔種植的問題，認為裸鼠皮下種植效果可能更好：①好觀察，種植于皮下時，結節塊明顯，容易測量；②存活率高，種植于皮下避免了多次開腹，會減少出血量及縮短手術時間，降低感染率；③給藥方便，可以皮下給藥、腹腔給藥，必要時也可以病灶給藥。但是因為就臨床研究看來，EMs患者的異位病灶多位于盆腹腔，裸鼠皮下種植的結果與腹腔內種植的結果及臨床研究是否一致有待研究。

另外，臨床所見EMs以卵巢居多，那在建立EMs動物模型時是否可以將病灶直接種植在裸鼠卵巢上呢？這樣是不是更加符合人EMs的發病情況呢？這一系列的問題有待進一步研究證實。

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