重慶植煙區(qū)叢枝菌根真菌資源調(diào)查及初選分析

劉先良++鄧茂++姚靖++程睿韜

摘要：對重慶市主要植煙區(qū)連作煙田叢枝菌根真菌資源進(jìn)行了調(diào)查，鑒定分析了煙草叢枝菌根真菌共7屬32種，包括球囊霉屬（Glomus）18種（包括新種1個(gè)），無梗囊霉屬（Acaulospora）7種，內(nèi)養(yǎng)囊霉屬）1種，盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）1種，巨孢囊霉屬（Gigaspora）1種，原囊霉屬（Archaespora）2種，近球囊霉屬（Paraglomus）2種。其中，球囊霉屬（Glomus）的根內(nèi)球囊（G.intraradices）和摩西球囊霉（G.mosseae）為煙草叢枝菌根真菌的優(yōu)勢菌種。

關(guān)鍵詞：叢枝菌根真菌；煙草；根內(nèi)球囊；摩西球囊霉

中圖分類號：Q939.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：16749944（2017）01001302

1引言

作為土壤真菌，叢枝菌根真菌在自然界中分布極其廣泛，能與大多數(shù)植物共生，形成“菌根”結(jié)構(gòu)[1]。目前，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，叢枝菌根真菌改善植物營養(yǎng)狀況，提高植物對土傳病害、干旱及鹽堿等生物和非生物脅迫的抗性已得到廣泛證實(shí)[2]，具有廣泛的應(yīng)用前景。煙草作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，為我國帶來了巨大的財(cái)政收入，煙草行業(yè)早已成為我國國民經(jīng)濟(jì)的重要組成部分。研究表明，接種叢枝菌根真菌能促進(jìn)煙草的生長[3]，并增強(qiáng)其抗病性[4]。因此，調(diào)查植煙區(qū)叢枝菌根真菌資源并篩選出優(yōu)勢種，可為解決重慶煙區(qū)生產(chǎn)所遇到的煙苗素質(zhì)低，土壤肥力不足，煙株抗逆性差等問題提供可能，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

2材料與方法

2.1采樣數(shù)量及方法

土壤采樣地點(diǎn)為重慶煙草主種植區(qū)彭水縣和巫山縣，選取有代表性的連作煙田采樣。樣品數(shù)量：彭水縣善感鄉(xiāng)8個(gè)、彭水縣鹿角鎮(zhèn)5個(gè)，彭水縣大青山村6個(gè)、彭水縣鄧家灣7個(gè)，巫山縣騾坪鎮(zhèn)5個(gè)，巫山縣篤坪鄉(xiāng)7個(gè)，巫山縣官渡鎮(zhèn)6個(gè)。共44個(gè)。

采樣方法：采樣時(shí)，在選擇采樣田塊內(nèi)，梅花法采樣。先去掉表土5 cm，取5～30 cm根圍土壤混合樣品2 kg，裝入土袋中，扎緊口袋，附上采樣標(biāo)簽。

2.2叢枝菌根真菌孢子的篩選和鑒定

采用濕篩傾注-蔗糖離心法分離原始土樣和培養(yǎng)物中的孢子，在體視顯微鏡下先觀察記載孢子的顏色、大小、連孢菌絲的特征、孢子果形態(tài)等；在此基礎(chǔ)上，用微吸管挑取孢子置于載玻片上，加水、乳酸、PVL、PVLG等作浮載劑，封片后在綜合顯微鏡下繼續(xù)觀察記錄孢子的顏色、連孢菌絲的特征，測定孢子的大小；壓碎孢子后再觀察內(nèi)含物的性質(zhì)、孢壁層次及各層顏色，測定各層孢壁的厚度等。鑒定中輔助使用Me1zer′s試劑，觀察孢子的特異性反應(yīng)；對有代表性或特異性的特征隨時(shí)進(jìn)行拍照。綜合以上觀察結(jié)果，根據(jù)“VA菌根真菌鑒定手冊[5]”及國際菌種保藏中心（INVAM）的分類描述，并參閱有關(guān)鑒定材料和近年來發(fā)表的新種等進(jìn)行種屬的檢索、鑒定；對于難確定的種或可能的新種、新記錄種進(jìn)一步進(jìn)行單孢培養(yǎng)，獲得大量的同源孢子，再確定種類。

2.3優(yōu)質(zhì)菌株的初步篩選

2.3.1供試材料

叢枝菌根真菌菌株：彭水縣和巫山縣煙田中分離的叢枝菌根真菌菌種。

宿主植物：云煙97，由重慶市煙草公司提供。

供試土壤：采自重慶市江津區(qū)，土壤為酸性紫色土。采集土壤后，風(fēng)干，揀除雜物，過篩，用滅菌鍋滅菌后備用。其基本理化性質(zhì)見表1。

2.3.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取孢子數(shù)量多的種進(jìn)行擴(kuò)繁，擴(kuò)繁方法參考孫丹萍[6]的方法。以土壤為基質(zhì)，采用多孢接種法，每處理5重復(fù)，不接種孢子處理作為對照組。每個(gè)培養(yǎng)管接種3個(gè)孢子，上覆蓋1.5 cm土壤，播種煙草種子3粒，再覆土0.5 cm。噴水保持濕潤。溫度控制在20～28 ℃，每日保證光照15 h，7 d后間苗，保留1株。

2.3.3樣品分析測定

60 d后，測定各處理的植株干重、根系侵染率、土壤中的菌絲密度及孢子數(shù)。菌根侵染率測定采用網(wǎng)格交叉法測定[7]；菌絲密度測定方法采用采用Abbott等人[8]的方法；孢子數(shù)的測定采用鏡檢法。

3結(jié)果分析

3.1重慶植煙區(qū)叢枝菌根真菌種質(zhì)資源調(diào)查結(jié)果

由表2可以看出，通過對重慶市彭水縣和巫山縣所采44塊煙田土壤樣品進(jìn)行鑒定，共分離出叢枝菌根真菌7屬32種，其中球囊霉屬（Glomus）18種（包括新種1個(gè)），無梗囊霉屬（Acaulospora）7種，內(nèi)養(yǎng)囊霉屬（Entrophospora）1種，盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）1種，巨孢囊霉屬（Gigaspora）1種，原囊霉屬（Archaespora）2種，近球囊霉屬（Paraglomus）2種。

3.2叢枝菌根真菌優(yōu)勢種的篩選

根據(jù)所調(diào)查的各土壤樣品中菌種孢子出現(xiàn)的頻率、孢子的形態(tài)及煙田煙草根系中菌根結(jié)構(gòu)的發(fā)育情況。為了提高菌株篩選的成功率，筆者的研究選擇了G. mosseae、G. intraradices、G. versiforme、G. etunicatum、G. clarum這5株孢子出現(xiàn)頻率較高及菌根結(jié)構(gòu)發(fā)育良好的菌株進(jìn)行擴(kuò)繁。

如表3所示，結(jié)果顯示接種叢枝菌根真菌各處理煙苗中均發(fā)現(xiàn)了菌根真菌侵染現(xiàn)象，未接種對照組未發(fā)現(xiàn)菌根侵染現(xiàn)象。侵染率、菌絲密度和孢子數(shù)由大至小依次均為：G. mosseae，G. intraradices，G. versiforme，G. etunicatum，G. clarum。其中，G. mosseae和G. intraradices兩菌種的侵染率高于G. versiforme、G. etunicatum、G. clarum三菌株20%以上。同時(shí)，其菌絲密度和孢子數(shù)也遠(yuǎn)高于G. mosseae、G. intraradices三者，這說明G. mosseae和G. intraradices兩菌株易于侵染煙草植株并能與之形成良好的叢枝結(jié)構(gòu)。

2017年1月綠色科技第1期

劉先良，等：重慶植煙區(qū)叢枝菌根真菌資源調(diào)查及初選分析

植物與植被

4討論

通過對重慶市主要植煙區(qū)彭水縣和巫山縣連作煙田叢枝菌根真菌資源調(diào)查，分析鑒定了煙草叢枝菌根真菌共7屬32種，其中球囊霉屬（Glomus）和無梗囊霉屬（Acaulospora）最多，分別有18種和7種，分別占總種數(shù)的56.3%、21.9%。此外還研究發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬（Glomus）叢枝菌根真菌菌株與煙草具有較高的親和力，易于侵染煙草根系并與之形成良好的菌根結(jié)構(gòu)。其中尤以根內(nèi)球囊（G. intraradices）和摩西球囊霉（G. mosseae）對煙草的侵染效果最佳，這二者為重慶植煙區(qū)煙草最優(yōu)叢枝菌根真菌種質(zhì)資源。此調(diào)查豐富了人們對煙草叢枝菌根真菌資源的認(rèn)知，為以后叢枝菌根真菌資源的開發(fā)及在重慶植煙區(qū)的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]Abbott L K，Robson A D.Factors influencing the occurrence of vesicular-arbuscular mycorrhizas[J].Agriculture Ecosystems and Environment，1991（35）：121～150.

[2]Jeffries P G，Gianinazzi S，Perotto S，et al.The contribution of arbuscular mycorrhizal fungi in sustainable maintenance of plant health and soil fertility[J].Biol Fertil Soils，2003，37（1）：1～16.

[3]江龍，王茂勝，黃建國，等.營養(yǎng)條件對接種叢枝菌根真菌煙苗生長的影響[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2010，29（3）：194～198.

[4]劉先良，習(xí)向銀，郭濤.接種叢枝菌根真菌對煙草青枯病抗性的影響[J].煙草科技，2014（5）：94～98.

[5]Shenck N，Perez Y.Manual for the identification of VA mycorrhizal fungi[M].3nd North Carolina：Schenck and Yvonne Perez，1990.

[6]孫丹萍.叢枝菌根真菌擴(kuò)繁技術(shù)研究[J].河南林業(yè)科技，2004，24（2）：12～14.

[7]盛萍萍，劉潤進(jìn).叢枝菌根觀察與侵染率測定方法的比較[J].菌物學(xué)報(bào)，2011，30（4）：519～525.

[8]Abbott L K，Robson A D，De-Boer G.The effect of phosphorus on the formation of hyphae in soil by the vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus，Glomus fasciculuntm[J].New Phytologist，1994，97（12）：437～446.