鹿紅方對心力衰竭大鼠過氧化物酶增殖物激活受體和心肌組織的影響

戎靖楓，封 舟，劉 茜，周耀中，王 詠，方宏鈞，周 華

·基礎醫學論著/研究·

鹿紅方對心力衰竭大鼠過氧化物酶增殖物激活受體和心肌組織的影響

戎靖楓，封 舟，劉 茜，周耀中，王 詠，方宏鈞，周 華

目的 觀察鹿紅方對心力衰竭大鼠過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)和心肌組織的影響。方法 分離鹿紅方全方水煎液，用蒸餾水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇洗脫，得到4種提取液，分別成為A、B、C、D液，分組為A組、B組、AB組、C組、AC組、BC組、ABC組、D組、AD組、BD組、ABD組、CD組、ACD組、BCD組，共14組，第15組曲美他嗪，第16 組假手術組。分別給96只通過冠脈結扎法制備充血性心力衰竭成功的大鼠模型灌胃。應用Western Blot檢測 (WB) 測定不同劑量的鹿紅方對心肌細胞PPARα蛋白表達的影響，對心肌組織進行HE 、VG染色，觀察心肌細胞病理形態結構。結果 鹿紅方具有明顯上調PPARa的作用，可以讓無序的心肌纖維定向排列，使心衰心臟的心功能得以改善，對心衰病理改變有顯著降膠原纖維的作用，有顯著降低 PVCA的功效。結論 不同劑型鹿紅方藥物血清組都可通過上調PPARα的表達，發揮其改善心肌組織功能作用，表明鹿紅方是中醫藥治療心力衰竭的良好藥物。

心力衰竭；鹿紅方；過氧化物酶增殖物激活受體；心肌組織；心悸

心力衰竭是當今臨床實踐中各種病因導致人類心臟功能下降的一種復雜綜合征，也是各種心臟疾病的嚴重和終末階段。近年來，國民心臟疾病的發病率、死亡率上升勢頭明顯，現已成為世界范圍內危害公眾健康的疾病之一[1]。心衰不僅對國民健康產生不良影響，也給社會公共衛生事業的健康發展帶來了挑戰。

據不完全統計，2014年全球心力衰竭病人數量已高達1.2億，我國現有此類病病人2 997.1萬，已超過全世界總量的四分之一，有可能成為全球擁有心力衰竭病人人群最多的國家。另有研究表明[2]，我國心力衰竭病人平均發病年齡為66周歲，比歐美、日本等發達國家提早至少4歲，主要是因為我國現有醫療技術還很難控制好心衰危險的核心要素，如果不及時進行診斷治療，影響心衰病人的藥物應用依從性效果。

心衰與心肌能量代謝密切相關，心衰的基本病因是原發性心肌損害(包括代謝障礙)或心臟負荷過重。如果心衰是由于心肌組織損傷引起，其癥狀體征首先表現為瘀血證；由于舒張功能作用減退和心肌無力收縮等原因導致血液不能回流，從病機轉化角度可推測，由于“瘀血”可引起心脈受阻，這會造成體內線粒體ATP銳減，根本原因是心肌組織細胞缺血缺氧而導致[3]，這也會產生心臟收縮跳動無力的氣虛，氣虛時心臟不能有效地推動血液流動，必然會引起血瘀或進一步加重血瘀。據研究，過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)是心肌代謝脂肪酸氧化酶基因主要的轉錄調節因子[4]，不僅在正常的心肌代謝穩態中起關鍵作用，而且它的信號改變和很多種疾病狀態的發病機制有關，因此，以PPAR作為阻止病理性心臟重構的治療策略為目的[5]。上海中醫藥大學附屬曙光醫院專門研制了臨床特效經驗方鹿紅方，它具有溫腎促陽、活血通絡和益氣強身的三種功效，特別是對心肌功能的恢復改善具有很好的促進作用，為有效緩解心力衰竭癥狀、延緩心力衰竭進程等[6]。本研究通過實驗數據來驗證鹿紅方對心力衰竭小鼠PPAR和心肌組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 雄性成年健康SD系，200 g±30 g，供貨方為上海中醫藥大學動物實驗中心。動物合格證號：SCXK( 滬) 2015-0016。

1.1.2 藥物 鹿紅方組成：鹿角、紅花、黃芪、桂枝、葶藶子、黨參。由深圳華潤制劑有限公司制作并提供中藥顆粒劑。

1.1.3 試劑和儀器 水平凝膠電泳系統Horizontal Gel、PCR儀Applied Biosystems ProFlexTM、一體化蛋白免疫印跡GE AWB、WB加速器SNAP i.d.。即時細胞分析儀ChemoNC-3000、倒置顯微鏡ECLIPSETS100、石蠟切片機Leica、相差顯微鏡DPH-200、ECLIPSE Ti

1.2 動物模型制備與分組 體內實驗：大鼠心肌梗死造模方法參照Johns 和Olson 的方法并加以改進[7]。用乙醚對實驗大鼠進行麻醉，對其皮膚進行消毒，術前心電圖也要做好記錄。在左側胸部心臟搏動最強處的上一肋間，刀切1.5 cm口，鈍性分離至胸壁。用剪刀捅胸腔，在上一肋骨與胸骨交界處剪斷，將心臟向左側破口處推擠，剪破心包膜后讓心臟復位，大鼠呼吸恢復正常后，將其心臟從胸腔中推擠出，左冠狀動脈前降支結扎必須在距動脈根部2 mm 處進行。將心臟推回進胸腔，并對開口的皮膚進行縫合，動物穩定后記錄標準

Ⅱ導聯心電圖( 紙速50/s)，ST段弓背抬高示心肌梗死形成，表明順利完成結扎。術后給予青霉素4×104U，皮下注射，連續3 d。造模成功后共96 只大鼠，據計算機編制的隨機分配表及正交設計方法隨機分為16 組，每組6只。灌胃需要用5 mL/d的藥液進行，空白組為第16組。術后給予青霉素4×104U，皮下注射，連續3 d。體外實驗：H9c2(2-1)大鼠的心肌細胞[8]，中國科學院細胞庫專門提供。

1.3 藥物干預方法 HP20型大孔吸附樹脂分離鹿紅方全方水煎液(濃度為2 g生藥/mL)，分別用95%乙醇洗脫、60%乙醇、30%乙醇和蒸餾水調配形成4 種提取液，分別簡稱為A：蒸洗液、B：30%液、C：60%液、D：95%液。揮盡回收乙醇后，以蒸餾水轉溶，調整體積(按比例折合含全方生藥12.5 g/mL)，罐封冷藏備用。各組藥液中適當增添生理鹽水，并調配形成濃度為2 g生藥/mL的藥液。術后2周開始，分別以A、B、AB、C、AC、BC、ABC、D、AD、BD、ABD、CD、ACD、BCD給14組灌胃給藥，連續8 周。第15組曲美他嗪10 mg/(kg·d)連續8 周。假手術組是第16 組，每天用生理鹽水5 mL/d 進行專門灌胃，時間確定為連續8 周。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 WB檢測 從組織中抽提蛋白，蛋白跑電泳，孵育目的體，顯色曝光。

1.4.2 病理分析 HE、VG染色：大鼠左室心肌標本用10% 甲醛溶液進行固定，并通過常規石蠟予以包埋，制備約0.4 μm 厚的連續石蠟切片，分別行快速VG染色、HE并觀察。計算膠原容積指數(ICVF)、血管周圍膠原面積/管腔面積比值(PVCA)。

2 結 果

2.1 WB檢測PPARα的相對表達量 第16組假手術組幾乎不表達PPARα，第5組的PPARα相對表達量0.32(見表1)，相對于第16組，PPARα的相對表達量(P< 0.05)，僅顯示有效，西藥組是第15組，該組表達量為21.87，效果最好。14組、12組、11組、10組、8組療效皆顯著，但總體療效都低于西藥組，且依次遞減。其余各組相比于療效顯著。

表1 WB檢測PPARα的相對表達量(±s)

2.2 Western blot實驗結果 (見圖1) 與假手術組相比，中藥組PPARa表達都有所增加，提示鹿紅方各劑型都可以提高PPARα的表達。H9C2大鼠心肌細胞PPARα蛋白表達會受到模型組的類別影響，從實驗的結果發現，各種劑型的鹿紅方藥物血清組對缺氧處理的H9C2 細胞會起到一定的保護作用，特別是都能增強H9C2細胞增殖活性，并可通過PPARα的表達上調，有效發揮其恢復和提升心肌組織功能作用，其中4組、6組、7組、14組、15組鹿紅方藥物血清組的功能作用最為明顯。該結果提示鹿紅方干預都具有明顯上調PPARa的作用。

圖1 Western blot實驗結果

2.3 假手術組和鹿紅方各組HE染色(見圖2) 第16組假手術組大鼠的心肌細胞邊界欠清，膠原纖維呈無序散亂纏繞狀，且有梗死透壁現象，空泡壞死面積大；中藥組的大鼠心肌纖維呈現束狀排列，心肌細胞、胞漿大小相對比較一致，形態規則，膠原纖維排列定向、緊密、整齊，基本無空泡，1組、2組、3組、6組邊緣有部分炎癥出現，成纖排列有序且基本無空泡炎癥。14組、12組、10組邊緣亦有炎癥出現，室壁中層有少量空泡，成纖排列基本有序；第15組西藥組部分空泡化及部分炎癥，成纖細胞排列較散亂，但排列比對照組稍緊密。鹿紅方讓無序的纖維定向排列，使心衰心臟的心功能得以改善。

圖2 大鼠心肌HE染色

2.4 病理組織VG染色(見圖3) 第1組、2組、6組、8組、10組紅色為膠原纖維，表明此處滲透性大。第15組、16組的空隙表明組織滲透性弱。第6、10組纖維化后VG染色明顯呈紅色，表示膠原纖維構成的疤痕形成，可能是原來心肌纖維被膠原膠原纖維代替，呈紅色。

圖3 大鼠心肌VG染色

2.5 膠原容積指數(ICVF) 是反應膠原纖維的量化指標，中藥干預各組與假手術組比較，都有顯著減少，其中第2組5.218%與第8組的5.198%相接近(見表2)，較其余各組的膠原容積指數稍高。第15組西藥組ICVF為3.522%，療效最顯著。提示鹿紅方各劑型雖比西藥組略高，但膠原容積都明顯少于假手術組，證明鹿紅方對心衰病理改變有顯著降膠原纖維的作用。

表2 膠原容積指數(±s)

2.6 血管周圍膠原面積/管腔面積比值( PVCA) 第8組PVCA為4.94%，與假手術組比較，顯著減少，但高于其他治療組(見表3)。第11組PVCA3.644，療效等同于第15組西藥組(見表3)。說明鹿紅方干預組都有顯著降低 PVCA的功效，尤其是第11組，療效等同于西藥組。

表3 血管周圍膠原面積/管腔面積的比值(±s)

3 討 論

3.1 鹿紅方組方原則 鹿角、桂枝、黨參、黃芪、南葶藶子及紅花等中藥成分是鹿紅方的主要原料來源。精選這六種藥材，主要考慮到：鹿角，溫肝益腎、補行精血，上通于心；桂枝的功效一般是溫心通陽；黨參、黃芪，主要用來益氣扶正，共為君藥；葶藶子，則為瀉肺平喘為佐使藥，這六種藥材融合使用，可以更好地調補陰陽、益氣強心、活血通絡之功效；紅花，則可活血通經、散瘀解毒，共為臣藥。這些知名藥材的融合使用，便可產生益氣強心、調補陰陽、活血通絡的功效。鹿紅方可以給予溫陽活血法，能更好地改善心衰癥狀及生化指標，臨床上對心力衰竭合并心絞痛的病人進行隨機跟蹤、比較、觀察發現，鹿紅方的綜合治療心衰疾病的效果特別明顯：該方中醫癥候改善總有效率、NYHA心功能分級改善總有效率、改善Lee心衰計分系統總有效率分別為82.8%、89.7%、55.0%，中醫證候療效高達80%。同時，也進行了機制探討，均證實鹿紅方臨床上是治療充血性心力衰竭合并心絞痛中醫辨證為心腎陽虛兼有血瘀的一個安全、有效的中藥制劑。

3.2 PPAR作用機制 過氧化物酶體增殖物激活受體，是由Issemann和Green兩位英國科學家通過克隆小鼠肝臟而獲取的，實際上PPARs是一類核轉錄因子，配體PPARα主要是在線粒體豐富的腸細胞、腎近曲小管細胞、心肌細胞，以及肝細胞等諸多細胞中呈高水平表達[9]。PPARs主要是進行調節細胞分化、能量代謝、過氧化物酶體增殖和炎癥反應等，這些變化主要存在于動脈粥樣硬化、高血壓、胰島素抵抗、糖尿病及腫瘤等常見疾病的病理過程中[10]。實驗表明，鹿紅方可以影響PPARα基因表達，輔助心肌細胞在體內脂肪酸的活化、攝取、代謝等[11]。病理研究表明：鹿紅方使得心肌代謝基因表達的PPARα中間控制作用被激活，通過恢復PPARα活性而潛在保護心臟，用于心肌肥大和心衰的治療[12]。

根據上海曙光醫院周華教授多年的臨床實踐，結合中醫理論所蘊含的“治心之所以治腎、而治腎之所以治心”理念，并在鞏固推廣多年臨床治療心力衰竭經驗成果的基礎上，探索研制由鹿角、桂枝、黃芪、黨參、紅花和葶藶子等中藥材組成的特效藥方鹿紅方，兼具通絡活血、調和陰陽、補心溫腎等多重功效。研究證實，鹿紅方在標本關系處理上，注重以益氣、扶正、治本為主，配以活血治標為輔助；在調和陰陽上，特別注重平補陰陽，以補陽為主；在心腎關系處理上，尤其強調心腎融合、心本乎腎，以溫腎促強心。對于各單味藥的研究，據記載：鹿角通常用以補腎壯陽，雖具有補腦強心的效能，卻很少用來延緩心力衰竭等病癥；現代醫學臨床表明，鹿角可以更好地改善蛋白質代謝障礙，加快能量代謝。黃芪可以促進肌體發育生長，增強肌體活動能力。黨參可以減輕身體疲勞，改善睡眠食欲[13]。對于紅花，主要通過熱水來提取，這種提取物具有顯著地抗血凝的作用，且對活化某些凝血活酶時間起到很好效果，同時也對膠原誘導的血小板和二磷酸腺苷(ADP)的聚集起到很好的抑制作用，并促使纖維蛋白溶酶和尿激酶的纖溶作用得到進一步加強[14]。這些中藥的醫療機制，有助于心力衰竭進程進行合理地調控和延緩，進而逐步緩解心衰病人的心絞痛癥狀。

綜上所述，作為一種治療心衰病人的特殊中藥，鹿紅方不但可以緩解甚至在某些時刻阻斷病人心力衰竭進程，適度減輕心絞痛等各種不良心臟病癥；如此，心衰病人不但可以增強參與心衰治療的信心，也可逐步提高治療的實效，同時病人的生活品質也可得到很大提升。

因此，通過多年的探索研究提出，鹿紅方臨床實踐效果明顯，可以作為一種治療充血性心力衰竭的安全藥物，特別是在今后治療心衰病人的臨床中進一步更大范圍的推廣。

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(本文編輯王雅潔)

Effect of Luhong Prescription on Peroxisome Proliferator-Activated Receptor and Myocardial Tissue in Mouse with Chronic Heart Failure

Rong Jinfeng，Feng Zhou，Liu Qian，Zhou Yaozhong，Wang Yong，Fang Hongjun，Zhou Hua

Shanghai Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai，China

Zhou Hua

Objective To observe the effects of Luhong prescription (LHP) on peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) and myocardium of mouse with congestive heart failure (CHF).Methods Separation water decocted solution of LHP was eluted with distilled water，30% ethanol and 60% ethanol，95% ethanol，extract，respectively，as a，B，C，D solution，grouped into A，B and AB，C，AC，BC and ABC，D，ad and BD，abd，CD，ACD，BCD in a total of 14 groups，group 15 (trimetazidine) and group 16 (sham operation group)，respectively.Ninety-six rat models of CHF were established by coronary artery ligation and administrated by intragastric administration.The protein expression of PPARα on cardiomyocyte was detected by western blot (WB).The pathological structure of myocardial tissue was observed by Haematoxylin-Eosin (HE) staining and Van Gieson (VG) staining.Results LuHong prescription can upregulate the function of PPARa obviously,it can make the muscle fiber orientation disordered,it can make the heart to improve the heart function of chronic heart failure.LuHong prescription can reduce collagen on the pathological changes of heart failure. LuHong prescription can reduce the efficacy of PVCA significantly.Conclusion LHP can upregulate the protein expression of PPARα on cardiomyocyte in rats with CHF.

Luhong prescription；heart failure；peroxisome proliferator activated receptor；myocardial tissue

國家自然基金面上項目(No.81373625)；國家自然科學基金青年科學基金(No.81303798)

上海中醫藥大學附屬曙光醫院(上海 201203)

周華，E-mail：zhouhuam@hotmail.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.010

1672-1349(2017)03-0293-05

2016-11-13)

引用信息：戎靖楓，封舟，劉茜，等.鹿紅方對心力衰竭大鼠過氧化物酶增殖物激活受體和心肌組織的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(3)：293-297.