中藥活性成分對oxLDL誘導血管平滑肌細胞泡沫化的影響

趙苗苗，王海芳，曹情雯，趙向絨，霍雪萍，孫晶瑩，王光華，胡 軍，劉勤社，3

中藥活性成分對oxLDL誘導血管平滑肌細胞泡沫化的影響

趙苗苗1，王海芳1，曹情雯2，趙向絨1，霍雪萍1，孫晶瑩1，王光華1，胡 軍1，劉勤社1，3

目的 探討中藥活性成分黃芪甲苷(Astragaloside IV，ASIV)、羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)和芍藥苷(paeoniflorin，PAE)對小鼠主動脈平滑肌細胞(ASMCs)泡沫化過程的影響，并探討其可能的分子機制。方法 體外培養小鼠ASMCs，并利用免疫熒光染色對其進行鑒定。利用氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和腫瘤壞死因α (TNFα) 誘導ASMCs泡沫化，并應用ASIV、HSYA和PAE進行干預，觀察其對泡沫細胞形成的影響，應用油紅O染色檢測細胞形態學改變、酶促比色法測定細胞內膽固醇含量變化；應用RT-PCR和Western blot方法檢測凝集素樣氧化型低密度脂蛋白1 (LOX-1 )表達的變化。結果 oxLDL (80 μg/mL) 和TNFα (30 ng/mL)聯用72 h可誘導ASMCs泡沫化，細胞內脂質顆粒明顯增多，細胞內膽固醇含量增加，LOX-1表達上調；ASIV、HSYA和PAE顯著抑制上述各過程。結論 ASIV、HSYA和PAE能夠抑制ASMCs泡沫化，抑制oxLDL誘導的LOX-1表達可能是其作用機制之一。

主動脈平滑肌細胞；氧化型低密度脂蛋白；凝集素樣氧化型低密度脂蛋白1 ；黃芪甲苷；羥基紅花黃色素A；芍藥苷；泡沫化過程；小鼠

動脈粥樣硬化(AS)是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的共同病理基礎，而心腦血管疾病已成為威脅人類健康的主要殺手[1]。AS發生、發展的核心環節和主要的細胞學改變是氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)等脂類物質在內膜下不斷蓄積所導致的泡沫細胞形成。有證據表明，45%的泡沫細胞是平滑肌細胞表型，只有30%是巨噬細胞表型[2]。活血膠囊主要由黃芪、紅花和赤芍等12味中藥組成，臨床治療冠心病療效確切，能有效改善氣虛血瘀證，改善血脂和血液流變學變化。動物實驗表明其可減少AS 斑塊內巨噬細胞浸潤，降低斑塊內 TNFα 表達及血清 IL-6 的水平[3]。黃芪甲苷(ASIV)、羥基紅花黃色素(HSYA)和芍藥苷(PAE)分別是黃芪、紅花、赤芍中含量最高的有效活性成分，前期研究表明，這些物質能夠抑制體外細胞中腫瘤壞因子α(TNFα)激活的信號通路，發揮抗炎作用[4]。本研究通過體外培養主動脈平滑肌細胞(ASMCs)并誘導其泡沫化，觀察ASIV，HSYA和PAE對平滑肌泡沫細胞形成的直接影響，初步探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 小鼠ASMCs購自上海諾晨生物技術有限公司。

1.1.2 試劑與藥物 TNFα購自美國Calbiochem公司；氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和油紅O購自上海魯汶公司；膽固醇測定試劑盒購自北京普利萊基因公司；RNA提取試劑盒購自TIANGEN BIOTECH；反轉錄及RT-PCR試劑盒購自TaKaRa；實驗所用一抗LOX-1、β-actin、-smooth muscle Actin(-SMA)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 ASMCs采用含有10% 胎牛血清的高糖DMEM培養液，37℃、5% CO2條件下培養。

1.2.2 免疫熒光染色鑒定 細胞接種在蓋片上，4%多聚甲醛固定；0.2% Triton X-100透化，5% BSA室溫封閉30 min，用1%BSA1∶50稀釋-抗孵育過夜，熒光二抗(1∶100)避光孵育30 min，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 油紅O染色 細胞培養于6孔板內，經處理后用PBS潤洗，4 %多聚甲醛固定15 min，油紅O染色液染色30 min，蘇木素復染。倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個區域進行拍照。

1.2.4 細胞內總膽固醇含量測定 培養細胞用PBS洗滌去除殘存培養液，按比例每1×106個細胞加入100 μL 裂解液，混勻，靜置10 min；取180 μL測定工作溶液加入微板，加入30 μL空白對照溶液、標準品或待測樣品；37℃ 反應30 min；繪制標準曲線并計算總膽固醇濃度。

1.2.5 Western blot法檢測凝集素樣氧化型低密度脂蛋白(LOX-1)蛋白表達 收集細胞裂解樣品，氨基黑法定量，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉NC膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉30 min，4℃一抗孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL法發光。

1.2.6 實時定量熒光RT-PCR 收集細胞，按說明書提取總RNA。以總RNA為模板反轉錄出cDNA鏈；采用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒以cDNA為模板進行PCR反應。引物：β-actin：正向引物 5′-TAGGCGGACTGTTACTGAGC-3′，反向引物5′-TGCTCCAACCAACTGCTGTC-3′； LOX-1正向引物5′- CCCTCCAAAGTCTCCCAACC-3′；反向引物5′-GCCTGCACTTGAGGAGGATT-3′。反應條件：95℃ 變性20 s，58℃ 退火30 s，72℃ 延伸45 s，設40個循環。以β-actin為內參基因，評價目的基因表達水平。

2 結 果

2.1 ASMCs鑒定(見圖1) 以抗-SMA抗體進行免疫熒光染色，結果如圖1a 所示，激光共聚焦顯微鏡下ASMCs呈現綠色熒光，陰性對照組(圖b，未加抗-SMA一抗)則未見熒光信號。

注：a為ASMCs b為陰性對照組

2.2 油紅O染色(見圖2) 對照組細胞內基本無紅色脂質顆粒，oxLDL誘導組及oxLDL+TNFα誘導組細胞內紅色脂質顆粒明顯增多，且oxLDL+TNFα誘導組更為顯著。與oxLDL+TNFα誘導組相比，TNFα+oxLDL+ASIV組，TNFα+oxLDL+HSYA組及TNFα+oxLDL+PAE組細胞內紅色脂質顆粒都有不同程度的減少。

注：a為CN；b為oxLDL；c為oxLDL+TNFα；d為TNFα+oxLDL+ASIV；e為TNFα+oxLDL+HSYA；f為TNFα+oxLDL+PAE

2.3 細胞內總膽固醇含量(見圖3) oxLDL誘導組及TNFα+oxLDL誘導組細胞內總膽固醇含量較對照組顯著升高，且TNFα+oxLDL誘導組升高更為顯著。與TNFα+oxLDL誘導組相比，ASIV，HSYA和PAE均可以降低細胞內總膽固醇含量(P<0.05)。

2.4 藥物對oxLDL誘導LOX-1基因表達的影響(見圖4) 如圖4a所示，oxLDL可誘導LOX-1 mRNA表達上調，其作用在6 h時最為明顯，因此我們選取6 h 為oxLDL作用時間。如圖4b所示，ASIV、HSYA和PAE(濃度100 μM)均能夠顯著抑制LOX-1 mRNA的表達。

圖3 藥物對細胞內總膽固醇含量的影響

注：圖α為oxLDL誘導LOL-1mRNA表達的時效關系(*P<0.05 vs CN；**P<0.05 vs CN)。

2.5 藥物對oxLDL誘導LOX-1蛋白表達的影響 圖5a所示，oxLDL可誘導LOX-1 蛋白表達上調，其作用在6 h～8 h時較明顯，選取6 h 為oxLDL作用時間。如圖5b所示，ASIV、HSYA和PAE(濃度100 μM)均能夠顯著抑制LOX-1 mRNA的表達。詳見圖5。

注：圖a為oxLDL誘導LOX-1蛋白表達的時效關系；圖b為藥物對oxLDL誘導的LOX-1蛋白表達影響

3 討 論

AS是脂類物質在血管內膜下不斷蓄積所致的血管炎癥性反應[5]，而泡沫細胞形成在AS的發生發展中扮演十分重要的作用，泡沫細胞形成有兩個主要生物學特征，包括細胞形態學改變，細胞圓形，體積較大，細胞質內脂類物質增多，或可形成脂滴；細胞內膽固醇含量增多[6-7]。這與油紅O染色及細胞內總膽固醇含量測定的結果相一致。

黃芪是中藥臨床常用中藥之一，首載于《神農本草經》，具有“補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌”等功效，古之醫家認為“補脾胃之氣及胸中宗氣乃黃芪所長”[8]，ASIV是黃芪中的主要活性成分，目前主要以其評判黃芪藥材的優劣[9]，現代藥理研究證實ASIV對心肌細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、腎臟、肺、腦、肝臟都具有一定的保護作用；紅花是傳統的活血化瘀類中藥，具有活血通經，化瘀止痛的功效。《本草綱目》記載其具有：“活血、潤燥、止痛、散腫、通經”的功效， HSYA作為中國藥典2010版規定的紅花最具代表性活性成分，是目前臨床用藥中為數不多的中藥注射劑之一[10]，發展前景可觀。現代藥理研究證實其具有降膽固醇、降血壓、保護心肌細胞、抗腦血栓形成等作用；赤芍為毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血、散瘀鎮痛之功效。唐宋之后漸有白芍、赤芍之分，《本草綱目》曰：“白補而收，赤散而瀉”。許文平等[11]研究發現芍藥苷可顯著抑制ApoE基因敲除小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，降低主動脈各段斑塊面積/主動脈血管管腔面積比值，表明芍藥苷具有明顯的降脂及抑制動脈斑塊形成的作用。Li等[12]發現芍藥苷可以通過上調ABCA1及下調CD36的表達抑制巨噬細胞源性泡沫細胞形成。本研究證明：ASIV、HSYA和PAE 能夠在體外實驗中通過降低細胞內膽固醇含量而抑制ASMCs泡沫化進而發揮抗AS作用。

LOX-1是近年來新發現的一類清道夫受體，在血管內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、泡沫細胞等均有表達，介導并參與oxLDL內吞和細胞內信號激活，促進AS的發生發展[13]。血管平滑肌細胞泡沫化與LOX-1的表達密切相關，ox-LDL可誘導血管平滑肌細胞的LOX-1表達上調，且高濃度oxLDL的誘導作用更強，提示LOX-1是結合或內吞oxLDL的重要受體[14]。本研究也證實：泡沫細胞形成后LOX-1基因及蛋白的表達均上調，且ASIV、HSYA和PAE可顯著抑制LOX-1基因及蛋白的表達。說明活血膠囊有效活性成分ASIV、HSYA和PAE抑制ASMCs泡沫化可能與LOX-1表達下調，脂類物質攝取減少相關。

但影響LOX-1表達的具體途徑尚不確定，oxLDL誘導的ASMCs泡沫化可能還與負責膽固醇運輸(ABCA1)及酯化(ACAT1)的基因相關，泡沫細胞形成時， ABCA1表達升高，而ACAT1表達下降，后期實驗中，將繼續深入研究活血膠囊活性成分ASIV， HSYA和PAE抗血管平滑肌細胞泡沫化的機制，為中藥抗AS提供理論基礎。

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(本文編輯王雅潔)

國家自然科學基金常規面上項目(No.81573823)；陜西省自然科學基金資助項目(No.2015 JM 8460)

1.西安交通大學醫學院第三附屬醫院陜西省人民醫院(西安 710061)；2.陜西省中醫醫院；3.陜西中醫藥大學

劉勤社，E-mail：lqsspph@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.014

1672-1349(2017)03-0310-04

2016-08-08)

引用信息：趙苗苗，王海芳，曹情雯，等.中藥活性成分對oxLDL誘導血管平滑肌細胞泡沫化的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(3)：310-313.