大鼠心肌損傷后S100A4的表達變化及其意義

李江濤，張國珺，嚴 鵬

大鼠心肌損傷后S100A4的表達變化及其意義

李江濤1，張國珺2，嚴 鵬3

目的 分析大鼠心肌損傷后S100A4的表達變化及其意義的研究。方法 選取清潔級雄性健康大鼠24只，體重(211.1±6.8)g。按隨機數表法隨機分為兩組對照組與心肌損傷組，每組12只。通過注射異丙腎上腺素進行心肌損傷大鼠的造模，進行取血及心肌組織，采用光鏡與電鏡對大鼠心肌進行組織學觀察；用蛋白免疫印跡法與免疫組織化學法檢測心肌蛋白表達。結果 對照組大鼠血液中的一氧化痰(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)值均顯著高于心肌損傷組大鼠，而心肌損傷組大鼠的乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)值均顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。對照組大鼠表達平均光密度顯著低于心肌損傷組大鼠表達平均光密度，差異具有統計學意義(P<0.05)；S100A4蛋白在心肌損傷組大鼠中的表達強，而在對照組大鼠中的表達弱。結論 大鼠心肌損傷后，S100A4蛋白在其心肌細胞中的表達變強。

心肌損傷；S100A4；異丙腎上腺素；心肌細胞

S100A4是一種多肽蛋，主要由101個氨基酸組成，屬S100蛋白家族，S100家族中已確定的成員總共有 21個，也是鈣離子結合蛋白家族中的最大亞家族之一[1-2]。有研究表明，S100A4 蛋白能促進腫瘤侵襲與轉移，并能調節細胞的多種功能，當其與鈣離子相結合，通過鈣離子信號的轉導途徑在其細胞增殖、分化、基因表達、肌肉收縮、分泌和凋亡中發揮著重要的作用[3-4]。S100A4蛋白能促血管生成，推測S100A4蛋白對心血管系統損傷可能起到保護作用[5-7]。本研究對大鼠進行心肌損傷造模，分析大鼠心肌損傷后S100A4的表達變化及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 蛋白定量試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；S100A4抗體(美國Promega公司)；考馬斯亮藍試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)；一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)(北京中生北控生物科技有限公司)；N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺(湖北艾丹醫藥化工有限公司)、發光顯跡液(美國santa公司) ；0.2 mm PVDF膜(美國Millipore公司)；十二烷基磺酸鈉(成都銀輝國際貿易有限公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(北京中山生物公司)；乳酸脫氫酶(LDH)；UV8500紫外-可見光分光光度計 (上海天美科學儀器有限公司)；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(美國進口)。

1.2 心肌損傷大鼠的造模 選取清潔級雄性健康大鼠24只，體重(211.1±6.8)g，購自昆明動物實驗中心，所有大鼠進行適應性喂養1周，按隨機數表法，隨機分為兩組，對照組12只，心肌損傷組12只。參考相關文獻，心肌損傷大鼠造模方法：采用皮下注射異丙腎上腺素(ISO)法，劑量為850 μg/kg。對照組不進行注射，正常喂養。待造模成功后，采用乙醚麻醉大鼠，取血待測，并迅速取其心肌，浸泡于戊二醛電鏡液中測定，剩余的采用液氮進行冷凍保存。

1.3 觀察指標 ①血液生化指標測定及方法，LDH活性測定采用比色法；MDA采用硫代巴比妥酸法；SOD活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法；NO含量測定采用硝酸還原酶法測定。②S100A4蛋白免疫組化檢測，大鼠灌注固定30 min，取其心尖部的心肌組織，并迅速浸泡在含4%多聚甲醛的組織固定液中，1周后再進行常規組織脫水、透明、包埋以及石蠟切片等，其片厚5 μm。取適量心肌組織進行勻漿，提取總蛋白，并用考馬斯藍法對蛋白濃度進行測定。取100 μg 的蛋白進行上樣，經十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后將蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，與一抗作用1 h后再與辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下作用 45 min，進行常規程序的顯影。最后采用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

2 結 果

2.1 心肌損傷后大鼠血液中NO、LDH、SOD、MDA的變化 對照組大鼠血液中NO、SOD值均顯著高于心肌損傷組大鼠，而心肌損傷組大鼠的LDH、MDA值均顯著高于對照組大鼠，差異具有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 大鼠血液中的NO、LDH、SOD、MDA的變化(±s)

2.2 大鼠心臟病理的電鏡觀察 對照大鼠心肌結構均基本正常，心肌纖維排列整齊，毛細血管通暢，結構清晰，且線粒體的結構致密，在心肌間質均未見明顯的滲出。而心肌損傷組大鼠心肌組織間質滲出明顯，毛細血管發生擴張，血管內皮細胞損傷明顯，且有部分細胞凋亡，心肌纖維排列稀疏，線粒體發生輕度腫大，并呈單層的排列在心肌纖維兩側，有部分的線粒體嵴發生不同程度的斷裂，偶見局灶性的壞死。詳見圖1。

2.3 S100A4在心肌中的表達 采用蛋白免疫印跡觀察S100A4在心肌中的表達，其結果顯示：對照組大鼠的S100A4的達較弱，而心肌損傷組大鼠心肌血管組織中S100A4表達較高。詳見圖2。

圖2 蛋白免疫印跡觀察S100A4在心肌中的表達

2.4 S100A4的蛋白免疫組化 兩組大鼠免疫組化結果表明：對照組大鼠心肌細胞內無棕黃色顆粒沉積，S100A4的表達較弱或不表達；心肌損傷組大鼠心肌細胞及毛細血管細胞內均出現較多的棕黃色顆粒，S100A4表達較強。經圖像分析顯示，對照組大鼠表達平均光密度顯著低于心肌損傷組大鼠表達平均光密度，差異具有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 S100A4的蛋白免疫組化(±s)

3 討 論

S100A4 蛋白結構的特點與其生物功能多樣性的相關十分密切。但對不同的S100 家族蛋白，通過對環繞的基本序列脯氨酸43進行分析，發現該區域對結構可塑性起著至關重要的作用[8-9]。異構化的脯氨酸是內在構象轉換的過程，此過程對指導其配體的識別與調控蛋白的活性有潛在作用[10]。S100A4中至少有1個蛋白可能會在鉸鏈區誘導特異的構象改變，且決定與靶分子之間的這種特殊蛋白-蛋白之間相互作用[11-12]。S100A4 蛋白與血管損傷、心肌損傷均具有一定的關系。其與血管再生及其胞外的基質重塑具有關聯性，甚至可作為獨立血管刺激因子發揮作用[13]。有研究發現，細胞內S100A4蛋白能刺激內皮細胞產生基質金屬蛋白酶(MMP13)，促進細胞外基質重塑，而基質降解與重塑是血管生成的一項必要步驟[14-15]。經研究發現，植入到大鼠角膜中的移植物釋放出的S100A4蛋白能夠在一定程度上誘導新血管生成[16-17]。有學者揭示，S100A4蛋白和膜聯蛋白Ⅱ(annexin Ⅱ)進行相互的作用，能促進組織的纖溶酶原激活物介導纖溶酶原激活，活化纖溶酶誘導血管生成[18-19]。

近年有學者新發現，S100A4蛋白有促血管生成的作用，其在心肌肥大的大鼠心臟中表達會表現為升高，并對胚胎干細胞具有一定促心肌生成作用，其提示著S100A4蛋白對心臟損傷可能具有保護作用[10-21]。通過免疫組化的定量分析顯示，心肌肥大人的心臟中炎性細胞S100A4蛋白表達升高[22-23]。但損傷前的心肌細胞中S100A4蛋白完全不存在，而在急性缺血后的梗死區心肌細胞中顯示存在S100A4蛋白被染色標定，但卻無S100A4mRNA的表達[24-25]。有研究證實，S100A4蛋白參與心肌的纖維化過程，且在異丙腎上腺素誘導損傷心肌中出現表達升高的情況，這可能是由于S100A4 蛋白與心肌的肥大以及心肌損傷有關的初步證據[26-27]。對于S100A4的調控機制目前尚未解釋清楚，這可能與干擾素、鈣離子、S100A4基因的低甲基化及結締組織的生長因子( connective tissue growth factor，CTGF) 等因素調控有關。但S100A4不僅受到鈣離子的調控，且干擾素γ(IFN- γ) 能夠在一定程度上抑制住S100A4的表達[28]。S100A4 蛋白與多種間質的細胞標志物共同存在于人與大鼠心臟中，使該項研究具有更為重要的臨床意義。通過研究 S100A4蛋白的重組對培養的心肌細胞發生直接作用，觀察S100A4 蛋白的重組體是通過依賴ERK1/2激活的狀態信號途徑，抑制住細胞的凋亡，對培養心肌細胞具有一定的促進生長與存活作用[29]。這提示著心肌損傷后 S100A4 蛋白可能是一個新表達上調的保護因子。Chen等[30]發現采用基因與藥物的干預，結果表現出 CTGF 介導 S100A4 的上調大部分取決于ERK1/2激活狀態，并且CTGF 與 S100A4表達的水平都與人的乳腺腫瘤相關密切。故推測 CTGF 可能在人乳腺腫瘤遷移與侵襲的過程中所發揮著關鍵的作用，主要是由于通過integrin-al-phavbeta3 -ERK1/2- S100A4 的通路激活實現。

本研究采用異丙腎上腺素對大鼠進行心肌損傷造模，對大鼠心肌損傷后S100A4的表達變化及其意義進行研究，結果發現，S100A4在心肌損傷組中的表達高于對照組，且對照組大鼠血液中的NO、SOD值均顯著高于心肌損傷組大鼠，而心肌損傷組大鼠的LDH、MDA值均顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，其原因是否也是S100A4通過該信號的途徑抑制細胞凋亡，對異丙腎上腺素誘導的心肌損傷大鼠起一定的保護作用，其作用機制尚需進一步研究。

S100A4與多種疾病的產生有著密切的聯系，不僅在胞內還能胞外發揮其生物學作用，這不但和組織的纖維化及腫瘤遷移等密切相關，還具有一定的促進某些組織和器官的再生能力。至今，對于S100A4 蛋白功能進行了一個比較全面的研究，但對于 S100A4 蛋白作用機制的研究還比較少，具體S100A4 蛋白在細胞的內外發揮著怎么作用以及其信號轉導途徑是什么? 其是否還存在著特異性的受體? 仍待進一步研究確定。相信隨著分子生物學的技術不斷發展，以及科研人員與學者對與S100A4 蛋白作用及其機制認識將會更加系統全面與深入，并為今后的心血管損傷防護新藥的研發與上市奠定基礎，并且能為心血管疾病診斷與治療開辟新的思路。

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(本文編輯王雅潔)

1.中國政法大學研究生院證據科學研究院(北京 100082)，

E-mail：liuzhiweits@163.com；2.太原市公安局晉源分局；3.西安交通大學 法醫學院

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.015

1672-1349(2017)03-0313-04

2016-12-19)

引用信息：李江濤，張國珺，嚴鵬，等.大鼠心肌損傷后S100A4的表達變化及其意義[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(3)：313-316.