苦蕎糖基轉移酶的鑒定與基因克隆

摘 要：糖基轉移酶除了決定糖苷鍵的形成，還可參與激素調節和信號轉導來影響植物的生命活動，如參與黃酮類化合物的代謝。本文通過生物信息學手段，分析鑒定出苦蕎的糖基轉移酶，并進行基因克隆，為進一步研究糖基轉移酶在黃酮代謝中的作用打下理論基礎。

關鍵詞：苦蕎；糖基轉移酶；生物信息；克隆

中圖分類號：S961.6 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131020

引言

糖基轉移酶存在于植物的高爾基體與內質網中，通過轉移活性糖基決定糖苷鍵的形成[1]。同時，該酶可以參與植物的激素調節和信號的轉導來影響植物的生命活動，還具有減少細胞內物質毒性，維持細胞內穩態和防御環境壓力的作用[2]。

苦蕎作為一類富含黃酮類物質的植物，不僅具有食用營養價值而且在保健方面也能起到很好的療效[3-5]。黃酮類化合物的存在可以使植物體更好地適應環境的改變，有利于提高植物體的生存和抗逆性[6-8]。糖基轉移酶可影響黃酮醇代謝底物的能力，在某些條件下轉換生產花青素 [9]。

1 材料與方法

1.1 材料

苦蕎幼苗。

1.2 試劑

氯仿、戊酮、異丙醇、無水乙醇試劑均為分析純；液氮，TE緩沖液。

1.3 主要實驗儀器

研缽、冷凍離心機、電子天平、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統。

1.4 生物信息在線分析網站及軟件

NCBI在線數據庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/；

PROSITE在線數據庫http：//prosite.expasy.org/；

蛋白理化性質分析使用Protparam；

Swiss-model在線數據庫http：//swissmodel.expasy.org/。

1.5 苦蕎基因組的快速提取

取苦蕎幼苗5g，加液氮研碎，吸入50ml離心管；

加入25mL氯仿—戊酮—乙醇（80：4：16）溶液，顛倒混勻；

冷凍離心機4℃下5000r/min離心5min；

移取上清液至25ml離心管中，加入等體積異丙醇，搖動至出現絮狀沉淀；

在1.5ml離心管中加入1mLTE緩沖液，用玻璃棒纏出DNA絮團溶于TE中。

1.6 苦蕎苦蕎糖基轉移酶基因的克隆

以苦蕎基因組為模板，利用PCR技術擴增苦蕎糖基轉移酶基因，所用引物為生工公司合成的5A'-ATCCATTCGTTTTA-3A'和5A'-CAGAAGTTATATTG-3A'。

2 結果與分析

2.1 苦蕎糖基轉移酶序列查找

通過NCBI網站，使用擬南芥中糖基轉移酶序列進行BLAST分析，搜索苦蕎中糖基轉移酶序列，結果如下：

SVGFKAGVKDYRLTYYTPEYQTKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYDIEPVAGEESQFIAFVAYPLDLFEEGSVTNLFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPPAYSKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRAVYECLRGGLDFTKDDENVNSQPF。

2.2 蛋白質的理化分析

為了更加準確了解糖基轉移酶，利用生物信息分析軟件Protparam對其進行理化分析，分析結果顯示：蛋白等電點為5.56，分子量22306.1Da，負電荷殘基25個，正電荷殘基23個，不穩定系數31.96，平均疏水性-0.339。

2.3 蛋白的功能域及保守域分析

使用PROSITE數據庫[10]對苦蕎糖基轉移酶氨基酸序列進行功能域和功能位點分析，找到了其所具備的蛋白功能結構域（圖1），結果顯示該序列含有特征結構域GTITASGDLVPLSYIAG，證明查找的蛋白序列存在糖基轉移酶的功能基礎。

2.4 苦蕎糖基轉移酶基因的克隆

分析驗證了查找到的苦蕎糖基轉移酶具有保守的功能結構域，為了進一步研究其在黃酮代謝中的作用，設計引物通過PCR技術擴增出約為800bp的基因片段（如圖2）。

3 結論

本文通過生物信息學方法鑒定出了苦蕎糖基轉移酶，其由202個氨基酸組成，大部分為疏水氨基酸，等電點PI為5.56，具有保守的功能結構域，是有生物活性的蛋白。苦蕎糖基轉移酶基因的克隆為進一步研究糖基轉移酶在黃酮代謝中的作用打下理論基礎。

參考文獻

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[10]鄒蔚然，郭萬株.蛋白激酶基因的克隆和生物信息學分析[D].四川農業大學，2008.

作者簡介：趙丹（1986-），男，山西太原人，研究生學歷，助教，研究方向：分子生物學。