Nexilin基因多態性與冠狀動脈病變程度的關系及機制

王曉平

(廣東醫學院附屬佛山禪城醫院，廣東 佛山 528000)

Nexilin基因多態性與冠狀動脈病變程度的關系及機制

王曉平

(廣東醫學院附屬佛山禪城醫院，廣東 佛山 528000)

目的 研究Nexilin基因多態性與冠狀動脈病變程度的相關性及可能機制。方法 胸痛患者573例，依據冠脈造影結果分為冠心病組344例，正常對照組229例。采用DNA序列測定技術，檢測兩組研究對象Nexilin基因外顯子及外顯子/內含子連接區的核苷酸序列。使用測序軟件與GenBank數據庫相關基因序列比對，對SNP位點進行序列分析。根據Gensini評分對冠脈病變程度進行評分，分析Nexilin位點多態性與冠脈病變程度的關系。結果 通過Nexilin基因外顯子SNP位點的序列分析，共發現2個SNP位點，其中1個為基因庫中收錄的rs1167781位點，另一個是新發現位點。對rs1167781位點G/A錯義突變進行分析，發現冠心病組患者攜帶A等位基因的頻率明顯低于正常對照組(P<0.01)。A等位基因頻率數量隨著Gensini評分增加呈明顯下降趨勢(P<0.05)。以Gensini評分為終點事件，Logistic回歸分析顯示rs1167781位點突變型和冠脈病變嚴重程度獨立相關。結論 Nexilin基因rs1167781位點多態性與冠心病患者冠狀動脈病變程度存在明顯相關性，為冠心病的保護因素。

Nexilin；單核苷酸多態性；冠狀動脈疾病

Nexilin基因是一個在心臟、動脈及靜脈中特異性表達的新基因。相關研究顯示，大鼠心肌缺血預適應組的左心室組織Nexilin基因比正常對照組上升3.2倍〔1〕，提示Nexilin是一個心肌缺血預適應啟動的潛在候選基因。冠狀動脈病變主要的病理生理基礎是動脈粥樣硬化，在多種作用因素中血脂異常和炎癥機制發揮重要作用〔2〕。本研究對Nexilin基因外顯子、外顯子/內含子連接區進行序列掃描分析，探討 Nexilin基因多態性與血脂及冠狀動脈病變程度的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2015年6月因新發胸痛來本院就診的患者573例。篩選標準：①漢族患者，入院后同意留取血清標本監測血脂基因，接受冠脈造影術；②排除有嚴重肝腎功能不全，既往接受支架植入術，存在家族遺傳性高脂血癥患者。依據冠脈造影結果分為冠心病組(1支及以上主要冠狀動脈狹窄>50%)344例，正常對照組229例。冠心病組中男283例，女61例；年齡56～81歲，平均(65.91±9.53)歲；長期吸煙史103例(29.94%)、高血壓史195例(56.69%)、糖尿病史132例(38.37%)。正常對照組中男110例，女119例；年齡54～85歲，平均(64.17±11.08)歲；長期吸煙史42例(18.34%)、高血壓史125例(54.59%)、糖尿病史37例(16.16%)。兩組患者平均年齡、高血壓史均無統計學差異(P>0.05)；冠心病組中男性患者、長期吸煙史、糖尿病史比例明顯高于正常對照組(P<0.05)。

1.2 方法

1.2.1 Nexilin目的基因提取 入院后次日清晨采集患者空腹肘靜脈血3 ml，置于抗凝管中混勻，取其中1 ml立即進行基因組DNA提取，余下的2 ml置于-80℃冰箱中保存備用。將血液加入1.5 ml離心管中加入900 μl紅細胞裂解液、150 μl血細胞，混勻后靜置10 min；4℃、 12 000 r/min離心10 min，靜置5 min后棄去上清；加300 μl細胞裂解液，震蕩30 s后37℃水浴至透明，加150 μl蛋白沉淀液，震蕩搖勻后以4℃、 12 000 r/min離心1 min。取1.5 ml離心管，加入400 μl異丙醇，再加以上處理得到的上清液，混勻至成絮狀物，4℃、12 000 r/min離心1 min，棄去上清，加400 μl 75%乙醇，混勻，4℃、 12 000 r/min離心1 min，棄去上清，空氣干燥10 min；加100 μl DNA水合物，混勻后65℃水浴10 min，室溫條件下靜置24 h，檢測濃度后置于-80℃冰箱中凍存。

1.2.2 Nexilin基因擴增與測序 PCR法擴增Nexilin基因DNA 433堿基5′末端片段，反應體系50 μl，包括無菌蒸餾水32 μl，Buffer 10 μl，dNTPs(2 mmol/L)5 μl，MgSO4(25 mmol/L)5 μl，引物(10 mmol/L)1.5 μl，cDNA 1 μl，PCR酶1 μl；反應程序采用常規兩步法，共25個循環，引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。使用310型全自動DNA測序儀對上述獲得的PCR擴增產物進行反向測序：對擴增得到的PCR產物進行電泳和PCR法測序，乙醇法除去PCR產物中的雜質。

1.3 統計學分析 使用SPSS15.0軟件行t檢驗、χ2檢驗、Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1 Nexilin目的基因片段PCR擴增結果 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示第7、8號外顯子擴增片段約為552 bp；第9號外顯子擴增片段約為458 bp；第11號擴增片段約為443 bp，與預期分子量符合。見圖1。

2.2 Nexilin目的基因片段測序結果 對7、8、9、11號4個外顯子進行測序分析，最終測出2個SNP位點。1個為基因庫中的rs1167781位點，為Nexilin基因第8個外顯子區G/A錯義突變，是該基因cDNA序列的1030堿基，密碼子由GGA→AGA，見圖2。新發現1個位點，第9外顯子區A/G錯義突變為1195A/G，密碼子由AAA→GAA，見圖3。

1 DNA標準帶；2、3為第11外顯子片段；4、5為第9外顯子片段；6、7為第7、8外顯子片段圖1 目的基因片段電泳圖譜

a野生純合子；b雜合子；c突變純合子；箭頭為SNP位點圖2 rs1167781 SNP位點測序結果

a野生純合子；b雜合子；箭頭為SNP位點圖3 第9外顯子1195A/G位點測序結果

2.3 兩組Nexilin 基因rs1167781位點基因型和等位基因頻率比較 冠心病組患者攜帶A等位基因的頻率明顯低于正常對照組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組患者rs1167781位點基因測序比較〔n(%)〕

2.4 rs1167781位點等位基因頻率與冠脈病變程度的關系 A等位基因頻率數量隨著Gensini評分增加呈明顯下降趨勢(χ2=9.503，P<0.05)。見表2。

2.5 rs1167781位點多態性與冠脈病變程度多因素分析 以Gensini評分為終點事件，Logistic回歸分析顯示，rs1167781位點的突變型和冠脈病變嚴重程度獨立相關。調整性別、長期吸煙史、糖尿病史、各血脂指標后，rs1167781位點變異仍獨立相關。見表3。

表2 不同冠脈病變程度患者rs1167781位點等位 基因頻率〔n(%)〕

表3 rs1167781位點多態性與冠脈病變程度的 多因素Logistic回歸分析

3 討 論

Nexilin作為一個新的肌動蛋白結合蛋白其基因功能目前尚未明確，最新研究顯示Nexilin可誘導細胞黏附和遷移，在細胞肥大及心肌缺血預適應模型中表達水平明顯提升〔3〕，說明該基因可在心臟多種病理改變過程中發揮作用。本次研究針對心肌組織特異性表達的Nexilin基因，其結構包括基因庫中nexn基因的第7～12外顯子，在第8、9、11外顯子區域內存在4個錯義SNP。因第7個內含子只有102個堿基，因此本次研究將第7、8外顯子作為一個片段進行擴增與測序。

通過對7、8、9、11號4個外顯子SNP位點進行序列分析，最終發現2個SNP位點。在第8外顯子區G/A錯義突變，正好處在基因的一個核定位信號區域，推測其對該基因功能造成一定影響。通過對本地區漢族人該位點的分析，結果顯示冠心病組患者攜帶A等位基因的頻率明顯低于正常對照組。

本次研究對冠脈病變程度與rs116778位點多態性關系分析說明rs1167781位點突變型是冠狀動脈病變的保護因素?？赡茉驗閞s1167781基因啟動子區域的第8個堿基發生突變(G置換A)，進而破壞了MspI限制性內切酶識別位點，產生的突變型可能影響基因的轉錄及表達，緩解心肌細胞缺血缺氧損傷〔4〕，同時還可降低心肌細胞的炎癥反應〔5〕。

1 Shibata N，Nagata T，Shinagawa S，etal.Genetic association between APOA1 and APOD polymorphisms and Alzheimer's disease in a Japanese population〔J〕.J Neural Transm，2013；120(11)：1599-603.

2 Dawar R，Gurtoo A，Singh R.Apolipoprotein A1 gene polymorphism(G-75 Aand C+83T) in patients with myocardial infarction：a pilot study in a North Indian population〔J〕.Am J Clin Pathol，2010；134：249-55.

3 Rai TS，Khullar M，Sehrawat BS，etal.Synergistic effect between apolipoprotein E and apolipoprotein A1 gene polymorphisms in the risk for coronary artery disease〔J〕.Mol Cell Biochem，2008；313：139-46.

4 Mirguet O，Lamotte Y，Donche F，etal.From ApoA1 upregulation to BET family bromodomain inhibition：discovery of I-BET151〔J〕.Bioorg Med Chem Lett，2012；22(8)：2963-7.

5 Bandarian F，Hedayati M，Daneshpour MS，etal.Genetic polymorphisms in the APOA1 gene and their relationship with serum HDL cholesterol levels〔J〕.Lipids，2013；48(12)：1207-16.

〔2016-05-09修回〕

(編輯 郭 菁)

王曉平(1960-)，女，副主任醫師，主要從事老年冠狀動脈病變研究。

R54

A

1005-9202(2017)04-0812-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.012