維甲酸聯(lián)合膽汁酸對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡的影響及初步機(jī)制研究

曾國祥　王琦　熊娟

[摘要] 目的 探討維甲酸聯(lián)合膽汁酸對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡的影響及初步機(jī)制。 方法 選用不同濃度的維甲酸及脫氧膽酸鈉，分別或聯(lián)合作用于人結(jié)腸腺癌HT-29細(xì)胞，檢測細(xì)胞的增殖以及抑制凋亡情況。 結(jié)果 維甲酸聯(lián)合膽汁酸可以有效抑制HT-29細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用（P<0.05）。 結(jié)論 維甲酸聯(lián)合膽汁酸能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，且抑制凋亡的程度與濃度相關(guān)，能夠為結(jié)腸癌的治療提供參考。

[關(guān)鍵詞] 維甲酸；膽汁酸；結(jié)腸癌；細(xì)胞增殖；抑制凋亡

[中圖分類號] R735.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）01-0008-03

結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國僅次于胃癌和食道癌，居消化道惡性腫瘤的第3位。隨著我國居民生活質(zhì)量以及飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)腸癌的臨床發(fā)病率越來越高。腸腔內(nèi)部微環(huán)境的變化同結(jié)腸癌發(fā)病之間的聯(lián)系受到人們的重視，并且研究人員發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生發(fā)展同動物脂肪的攝入存在聯(lián)系，推測原因是高脂飲食會加大腸腔內(nèi)部的脫氧膽酸，脫氧膽酸作為膽汁酸的一種，能夠通過誘發(fā)細(xì)胞DNA的損傷而誘導(dǎo)結(jié)腸癌出現(xiàn)[1]。維甲酸（ATRA）有著廣泛抗腫瘤增殖的活性，能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥性，不過大劑量使用的毒副作用較為明顯，這就需要探索聯(lián)合用藥抑制細(xì)胞增殖的小劑量ATRA。本研究分析ATRA聯(lián)合膽汁酸脫氧膽酸對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖以及凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

結(jié)腸癌細(xì)胞株為SW116，細(xì)胞培養(yǎng)瓶以及培養(yǎng)板為Nuck公司生產(chǎn)，培養(yǎng)基以及MTT為Promaga公司生產(chǎn)，小牛血清為杭州四季清公司生產(chǎn)，脫氧膽酸為上海華美公司生產(chǎn)，兔抗人COX-2抗體為Neomarkers公司生產(chǎn)，ATRA為sigma公司生產(chǎn)，酶標(biāo)儀型號為Elx800。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)以及藥物準(zhǔn)備 腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)時選用胎牛血清培養(yǎng)液，條件設(shè)置方面，溫度37℃，CO2 5%，濕度100%，培養(yǎng)細(xì)胞1 d到對數(shù)生長期，在弱光條件下?lián)Q液后進(jìn)行實(shí)驗[2]。使用100 mg的ATRA加入乙醇當(dāng)中配成10 mmol/L的母液，在-20℃條件下避光儲存。實(shí)驗所需要的ATRA使用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，且全部實(shí)驗均需要重復(fù)3次進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。HT-29細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI-1640溶液，添加胎牛血清、鏈霉素以及青霉素，37℃條件下傳代培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的生長狀況[3]。

1.2.2 MTT實(shí)驗 取對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞接種到96孔板，每孔10 000。細(xì)胞貼壁1 d之后按組別添加濃度10、50、100 μmol/L的ATRA，每孔20 μL，每組共5個復(fù)孔，持續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h或72 h，在反應(yīng)終止前吸去培養(yǎng)液，并加入RPMI-1640培養(yǎng)基，孵箱內(nèi)3 h之后棄上清，使用異丙醇100 μL溶解結(jié)晶振蕩10 min之后應(yīng)用酶標(biāo)儀讀取值[4]。

1.2.3 細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡 HT-29細(xì)胞根據(jù)5×105/mL接種到6空板，每孔3 mL，1 d之后按組別加入不同濃度的脫氧膽酸，每孔3 mL，每組設(shè)置5個復(fù)孔。作用1 d之后收集貼壁以及懸浮的細(xì)胞，根據(jù)說明書使用細(xì)胞儀進(jìn)行檢測[5]。

1.2.4 免疫細(xì)胞染色 HT-29細(xì)胞根據(jù)5×105/mL接種到6空板，每孔3 mL，在1 d之后分別加入不同濃度的脫氧膽酸，每組設(shè)置3個復(fù)孔。作用1 d之后終止反應(yīng)并吸去培養(yǎng)液。使用冷丙酮進(jìn)行10 min固定，PBS反復(fù)進(jìn)行3次沖洗，滴加100 μL的兔抗人COX-2抗體，5℃冰箱儲存，第2天使用PBS反復(fù)進(jìn)行3次沖洗，滴加100 μL羊抗兔IgG-HRP，并37℃孵育1 h，PBS反復(fù)進(jìn)行3次沖洗之后DAB顯色，脫水，透明，使用樹膠封片[6]。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

結(jié)果判定方面，COX-2及caspase-3染色定位到細(xì)胞質(zhì)。PARP-1染色定位到細(xì)胞核，其中陽性物質(zhì)為棕黃色或黃色的顆粒。每張玻片選取3個視野（×400），每個視野統(tǒng)計100個細(xì)胞，由病理科醫(yī)師使用相關(guān)軟件來測定三者的密度值之后取均值[7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

檢測數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度/時間ATRA對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制率

不同濃度/時間的ATRA對于細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，8 μmol/L的ATRA在作用72 h之后對腫瘤細(xì)胞的抑制效果顯著優(yōu)于24 h以及48 h（P<0.05），見表1。

2.2 ATRA聯(lián)合脫氧膽酸對HT-29細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果表明，10 μmol/L的脫氧膽酸聯(lián)合8 μmol/L的ATRA作用HT-29細(xì)胞24 h，能夠增加HT-29細(xì)胞的凋亡，同時細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并且S期細(xì)胞明顯減少（P<0.05），見表2。

2.3 ATRA聯(lián)合脫氧膽酸對HT-29細(xì)胞COX-2、PARP-1及caspase-3表達(dá)的影響

免疫細(xì)胞化學(xué)染色和光密度分析結(jié)果顯示，ATRA聯(lián)合脫氧膽酸可以有效抑制HT-29細(xì)胞的生長，顯著優(yōu)于單用ATRA或單用脫氧膽酸，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3結(jié)論

腫瘤可以說是多種基因改變誘發(fā)的細(xì)胞增殖，使得細(xì)胞周期的調(diào)控出現(xiàn)問題，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常分化。細(xì)胞周期控制點(diǎn)以及蛋白表達(dá)的失控可以說是腫瘤增生的一個重要影響因素。ATRA能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分化以及逆轉(zhuǎn)功能，推測起作用途徑在于癌細(xì)胞ATRA受體互相作用或借助于抑制細(xì)胞表面的黏附蛋白而發(fā)揮影響。近年研究結(jié)果顯示，ATRA能夠誘導(dǎo)小鼠的胚胎癌細(xì)胞進(jìn)一步分化成為纖維母細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，同時也能夠分化成熟超過90%的人類白血病細(xì)胞株，同時體現(xiàn)出成熟細(xì)胞的功能以及形態(tài)[8]。在接種不同濃度的ATRA來處理肺癌細(xì)胞株到Boyden小室之后，癌細(xì)胞的侵襲功能顯著下降，并且同接種的濃度存在直接的聯(lián)系。這意味著ATRA有著影響癌細(xì)胞運(yùn)動以及抑制癌細(xì)胞粘附的效果。

有研究報道經(jīng)過ATRA處理之后的胃癌細(xì)胞株在接種到裸鼠之后，同未接種的裸鼠比較，接種裸鼠的腫瘤生成率及直徑均顯著下降。電鏡觀察結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)從橢圓形、大核、周邊凹陷改變?yōu)殚L橢圓形、小核以及核周邊光滑，同時癌細(xì)胞的G0/G1百分比上升，S期以及M期的百分比明顯下降，意味著ATRA對實(shí)體瘤能夠發(fā)揮一定的治療效果[9]。本研究的結(jié)果顯示，ATRA對體外結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能夠發(fā)揮明顯的抑制效果，抑制癌細(xì)胞增殖并加速癌細(xì)胞的分化，同時抑制強(qiáng)度同ATRA的濃度存在著正相關(guān)關(guān)系[10]。TRA能夠借助于誘導(dǎo)癌細(xì)胞當(dāng)中的線粒體基因來調(diào)控腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)與分化。ATRA一方面對白血病能夠發(fā)揮理想的治療效果，另一方面能夠借助于干預(yù)多種不同的腫瘤細(xì)胞因子，來控制細(xì)胞增殖[11]。本研究的結(jié)果顯示，ATRA對于體外結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有著明顯的抑制效果，并且同ATRA濃度存在正相關(guān)，ATRA的濃度越高，抑制效果就越為顯著（P<0.05）。需要注意的是，本研究并未直接觀察ATRA對實(shí)體瘤直接的作用，要想確定ATRA對于結(jié)腸癌治療的效果，還需要在后續(xù)的研究中觀察ATRA對于實(shí)體瘤細(xì)胞以及結(jié)腸癌患者的效果。

COX-2在不同類型的腫瘤組織當(dāng)中都存在過表達(dá)，同結(jié)腸癌出現(xiàn)及惡化有著密切的聯(lián)系。抑制COX-2能夠下調(diào)周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，并可以上調(diào)caspase-3的表達(dá)，阻滯細(xì)胞的周期從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[12]。常見的細(xì)胞凋亡路徑包括細(xì)胞內(nèi)凋亡以及細(xì)胞外凋亡，后者主要是激活死亡受體并且活化caspase-3，前者主要是借助于線粒體釋放色素來活化caspase-3，從而裂解PARP-1讓其喪失修復(fù)DNA的作用，加速腫瘤細(xì)胞的凋亡[13]。本研究結(jié)果提示，脫氧膽酸能夠借助于調(diào)高COX-2蛋白的表達(dá)而加速結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖（P<0.05）。有研究人員發(fā)現(xiàn)PARP-l抑制劑對于人肝癌細(xì)胞株的生長能夠發(fā)揮抑制效果，但在存在脫氧膽酸的條件下是否可以發(fā)揮這一效果還不確定。本研究的結(jié)果顯示，脫氧膽酸可以加速結(jié)腸腺癌HT-29菌株的增殖，提高COX-2及PARP-1的表達(dá)，降低caspase-3的表達(dá)，這表明經(jīng)過脫氧膽酸的作用之后，一方面可以損傷HT-29菌株的細(xì)胞DNA，從而調(diào)整PARP-1表達(dá)并修復(fù)DNA，另一方面可以借助于誘導(dǎo)COX-2表達(dá)而控制細(xì)胞色素，尤其是caspase-3的活性，最終抑制細(xì)胞的凋亡[14]。這可以說是脫氧膽酸刺激HT-29細(xì)胞增殖的一個影響因素。脫氧膽酸同ATRA聯(lián)合作用于HT-29細(xì)胞之后，可以抑制脫氧膽酸對HT-29菌株細(xì)胞的增殖效果，從而阻滯細(xì)胞的周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低COX-2以及PARP-1蛋白的表達(dá)。脫氧膽酸損傷DNA之后需要PARP-1進(jìn)行修復(fù)，而ATRA作為PARP-l的抑制劑可以降低PARP-1的活性，使得其無法同DNA的缺口進(jìn)行結(jié)合，從而喪失修復(fù)損傷的作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。除此之外，有研究人員認(rèn)為二者連用能夠抑制HT-29同內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，聯(lián)系本研究當(dāng)中COX-2表達(dá)同PARP-l表達(dá)之間的一致性，推測二者之間存在聯(lián)系[15]。

綜上所述，ATRA聯(lián)合膽汁酸能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，同時其抑制凋亡的程度同濃度相關(guān)，能夠為結(jié)腸癌的治療提供參考。

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（收稿日期：2016-06-26）