香砂六君丸對肥胖大鼠胃黏膜JAK2/STAT3通路的影響

陳偉仁　劉文俊　柴紀嚴　劉旭東　劉慧慧　于化新　王凌志　王路　馬丹　王德山　單德紅

【摘要】 目的：研究香砂六君丸對肥胖大鼠胃黏膜JAK2和STAT3表達的影響，探討該方控制肥胖人群罹患胃癌風險的可能性。方法：40只雄性SD大鼠，隨機分為對照組、肥胖組（模型組）、香砂六君丸低劑量治療組（香低組）、香砂六君丸中劑量治療組（香中組）和香砂六君丸高劑量組治療組（香高組），每組8只；全自動生化分析儀檢測血脂；ELISA法檢測血清超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性；免疫組化法檢測胃黏膜磷酸化（p）-JAK2/STAT3表達。結果：與對照組比較，模型組的總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）和MDA水平以及p-JAK2、p-STAT3表達均顯著增加，但SOD和高密度脂蛋白（HDL）水平以及GSH-px活性均明顯下降。與模型組相比，香低、中和高組的TG和LDL水平顯著下降，而SOD水平和GSH-px活性明顯上升；香中組和香高組MDA水平和p-JAK2、p-STAT3表達均顯著下降；香高組HDL水平明顯上升。結論：香砂六君丸能夠調控血脂，對抗氧化應激，抑制胃黏膜JAK2/STAT3通路，可能具有降低肥胖人群罹患胃癌的作用。

【關鍵詞】 香砂六君丸； 肥胖； 胃黏膜； JAK2； STAT3

隨著現代社會膳食結構的改變和體力活動日漸減少，肥胖的患病率無論在發達國家還是發展中國家均以驚人的速度增長，以美國和中國最為嚴重。肥胖能夠引發眾多疾病，特別是可以明顯增加消化道腫瘤的罹患風險，但具體機制尚不清楚。近年研究發現，肥胖人群多存在血脂異常和氧化應激，進而通過激活JAK2/STAT3信號通路，引起細胞異常增殖和惡性轉化，參與了包括胃腸道腫瘤在內的諸多惡性腫瘤的發生及發展[1-5]。臨床報道顯示香砂六君丸對消化道潰瘍和慢性胃炎等均有一定療效[6-8]，其機制與調節血脂和對抗氧化應激等有關。由此推測，香砂六君丸可能具有預防肥胖人群罹患胃癌的作用，但相關報道還較少。因此，本實驗以肥胖大鼠為實驗對象，主要從JAK2/STAT3信號途徑方面探討香砂六君丸的預防作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SPF級SD大鼠，3～4個月齡，體質量（200±10）g，遼寧省本溪巿實驗動物中心提供[合格證號：SCXK（遼）-2010-0001]，于遼寧中醫藥大學實驗動物中心飼養[許可證號：SYXK（遼）-2013-000-9]。室溫（22±1）℃，相對濕度（50±5）%，自由飲水進食，光∶暗=12 h∶12 h，飼養1周進行適應后，開始實驗。

1.2 試劑與藥物 香砂六君子丸購于河南省宛西制藥股份有限公司（批號140603）；生化質控物（批號0413021）購于四川邁克生物科技股份有限公司；超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒均購于上海尚樂公司（批號DZE30169、DZE30157、DZE35104）；JAK2和STAT3多克隆抗體購于ABclonal（批號A0208、A2211）；Ultra SensitiveTM S-P超敏試劑盒（兔）和DAB，均購于福州邁新生物技術開發有限公司（批號KIT-9706、dab0031）。

1.3 儀器 美國伯樂iMark酶標儀，德國LEICA CM1850切片機，全自動生化分析儀（Accute TBA-40FR），成都泰盟科技公司BI-2000醫學圖像分析系統。

1.4 方法

1.4.1 分組 大鼠隨機分為對照組8只和肥胖組若干，分別給予普通顆粒飼料和高脂飼料（組成：基礎飼料55%，豬油15%，蔗糖20%，蛋黃粉9%，膽酸鹽1%）[9]，自由飲水。連續喂養180 d后，選擇體質量超過對照組（423.97±47.78）g 20%以上[10]的肥胖組大鼠32只（523.99±29.06）g，隨機分為肥胖組（模型組）、香砂六君丸低劑量治療組（香低組）、香砂六君丸中劑量治療組（香中組）和香砂六君丸高劑量治療組（香高組），每組8只。

1.4.2 給藥方法 香砂六君丸打粉后用蒸餾水沖調，按成人用量折算為大鼠用量，香低、中和高組分別按112.5、225.0和450.0 mg/kg計算出日用量，分早晚2次灌服，連續30 d。對照組和模型組灌服等體積蒸餾水，方法同前。

1.4.3 血清相關指標檢測 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（0.35 mL/100 g）后，腹主動脈取血，離心后取血清備用。取部分血清，采用全自動生化分析儀檢測血清是總膽固醇（TG）、總甘油三酯（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和高密度脂蛋白（LDL）水平；取部分血清，采用ELISA法，嚴格按說明書操作，檢測超氧化物岐化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）活性檢測。

1.4.4 胃黏膜JAK2/STAT3表達 采用免疫組化法。取麻醉大鼠胃組織，4 ℃鹽水洗凈，4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片；脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min；微波爐修復抗原5 min；滴加正常山羊血清，室溫放置20 min；滴加兔抗大鼠磷酸化（p）-JAK2或p-STAT3抗體50 μL（均濃度1∶100），37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜；滴加羊抗兔IgG抗體，室溫放置20 min；滴加SABC試劑，室溫10 min；DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照采用抗體稀釋液代替一抗，步驟同上。陽性結果為胞漿內出現棕黃色顆粒。利用圖像分析系統，光鏡下選取相同部位相同視野，分析免疫陽性染色的平均光密度。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血脂變化 與對照組比較，模型組的TG、TC和LDL水平均顯著上升（P<0.01，P<0.05，P<0.01），但HDL水平明顯下降（P<0.01）；與模型組相比，香低組、香中組和香高組的TG和LDL水平均顯著下降（P<0.01），但香高組HDL水平明顯上升（P<0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠氧化應激成分和JAK2/STAT3表達變化 與對照組比較，模型組SOD和GSH-px均顯著降低（P<0.05，P<0.01），但模型組MDA、p-JAK2和p-STAT3表達均顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，香低、中和高組SOD和GSH-px均明顯上升（P<0.05；P<0.05，P<0.01，P<0.01），香中和高組MDA水平和p-JAK2、p-STAT3表達均顯著下降（均P<0.01）。見表2。

3 討論

隨著肥胖癥發病率的日漸提高，社會和家庭的負擔也隨之增加，因此國內外開展了大量的研究工作，探索減肥和預防并發癥的方法。研究顯示，眾多減肥措施的初期效果明顯，但長期效果較差，常常出現反彈，這就需要研制一套長效減肥機制，但目前進展不大[11-12]。因此醫患不得不共同正視現實，在減肥的同時控制并發癥，極力維護患者的健康，提高生活質量。

血脂異常是肥胖人群常見癥狀，并可由此產生氧化應激，導致自由基產生過多，進而參與炎癥、過敏和腫瘤等眾多疾病的發生發展，因此調控血脂是防治肥胖人群罹患他病的重要手段。近年來降脂藥物的研發較多，也取得了一些成果，但兼具高效低毒的藥物還不多。中藥復方能夠多環節、多靶點起效，具有毒副作用小的特點，是調控血脂的重要選擇。香砂六君方出自《太平惠民和劑局方》，由木香、砂仁、黨參、白術、茯苓、炙甘草、陳皮、半夏、生姜和大棗等組成。該方以四君子湯為基礎加減化裁而成，其中人參、白術、茯苓、炙甘草益氣健脾，陳皮、半夏能夠和胃化濕，降逆止嘔，而木香、砂仁則可以疏通脾胃氣滯，消脹散滿，故全方可以健脾和胃，主治脾虛氣滯、消化不良、脘腹脹滿等癥。該方原為湯劑，1963年版《中國藥典》（一部）將黨參代替人參，制成水丸，稱為香砂六君子丸，后1977年版《中國藥典》將其改名為香砂六君丸，現又將水丸改進為濃縮丸劑，收錄于《衛生部藥品標準》（中成藥分冊）第七冊。

研究顯示，香砂六君丸能夠在一定程度上調節血脂和對抗氧化應激[13]。本研究也觀察到類似結果，如香低組、香中組和香高組的TG、LDL水平均顯著低于模型組，而香高組HDL水平明顯高于模型組（P<0.05）；香低組、香中組和香高組SOD和GSH-px均明顯高于模型組，而香中和高組MDA水平明顯低于對照組（P<0.05）。此外，在量效關系上來看，高劑量香砂六君丸的效果要更好。但研究發現，盡管采取了許多措施來控制血脂、對抗氧化應激，肥胖人群的腫瘤發病率還是要高于體質量正常的人群，原因可能還不清楚，推測與脂肪細胞能夠釋放眾多細胞因子有關。脂肪細胞也可以稱為內分泌細胞，能夠合成釋放干擾素、白細胞介素、表皮細胞生長因子等眾多成分，從而影響相關細胞的結構和功能[14-17]。雖然每個細胞因子的作用途徑有所不同，但多數都涉及了JAK2/STAT3信號通路。JAK2/STAT3通路能夠介導眾多細胞因子誘發的細胞異常增殖和分化，參與炎癥和腫瘤等一系列疾病的發生，目前是胃癌早期篩查的重要生物學標志物之一[18-21]。

本實驗觀察到，模型組大鼠胃黏膜p-JAK2和p-STAT3表達均明顯高于對照組（P<0.05），說明肥胖可激活胃黏膜細胞內JAK2/STAT3通路，提示該組大鼠胃黏膜細胞可能出現異常分化，是胃癌發生的一個先兆，因此及時干預此通路可能具有預防胃黏膜細胞分化的作用。香砂六君丸能夠健脾化痰和胃，能否用于胃癌防治還不清楚。本研究結果顯示，香中組和香高組的p-JAK2和p-STAT3表達均顯著低于模型組（P<0.05），表明中、高劑量的香砂六君丸能夠抑制肥胖大鼠胃黏膜細胞JAK2/STAT3通路，提示該藥可能具有對抗肥胖大鼠胃黏膜細胞異常分化的作用，但詳細作用還需要深入研究。

綜上所述，肥胖可引起血脂異常、氧化應激和胃黏膜細胞JAK2/STAT3異常激活，而香砂六君丸能夠調控血脂，對抗氧化應激，并抑制胃黏膜細胞JAK2/STAT3信號途徑的異常激活，可能具有預防胃黏膜細胞異常增殖和分化的作用。因此，可以考慮先期服用香砂六君丸，降低肥胖人群罹患胃癌的風險。

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（收稿日期：2017-01-20） （本文編輯：程旭然）