3種復方中藥含藥血清對NCI—H460細胞抑制作用的研究

廖遙靈　王柳萍　韋云妮　楊斌

【摘要】 目的：觀察3種復方中藥含藥血清對體外培養的NCI-H460細胞的抑制作用。方法：選用健康成熟SD大鼠，將大鼠隨機分為5組，分別為空白組、A復方組、B復方組、C復方組、環磷酰胺組，給藥后分離血清，56 ℃滅活30 min，用MTT法檢測含藥血清在24、48 h時對細胞的抑制作用。結果：24、48 h，三種復方中藥含藥血清的5%、10%、20%、30%濃度對NCI-H460細胞均有不同程度的抑制作用（P<0.01），尤以B復方組對NCI-H460細胞作用明顯，并呈一定的劑量依賴性。結論：3種復方中藥含藥血清對體外培養的NCI-H460細胞具有明顯的抑制作用。

【關鍵詞】 復方中藥； NCI-H460細胞； 血清藥理學

隨著環境污染的增加及人們各種不良的生活習慣，癌癥的發病率正在不斷上升[1]。癌癥是一大類惡性腫瘤的統稱，是目前嚴重危害人類健康的一大頑癥，嚴重威脅著人類的生活質量，被稱為人類健康的第一殺手[2]。肺癌屬于中醫學肺積、咳嗽、咯血、胸痛等范疇，一般認為肺癌的發生是由于人體正氣不足，陰陽氣血失調，使臟腑經絡的功能發生障礙，機體抗病能力降低，邪氣乘虛而入，滯留于肺，日久形成腫塊而成肺癌[3]。目前，癌癥的預防和治療方法已經有很多，雖然療效顯著，但是毒副作用大的問題使很多藥的臨床應用受到了限制[4]。中草藥以其毒副作用小、不易產生耐藥性的優點在腫瘤治療領域越來越受重視。中草藥復方、單味藥提取物或一些單體成分可抑制脂質過氧化反應、清除活性氧自由基、提高機體抗氧化酶活力[5-6]，從而抑制癌癥。近年來，中草藥在抗癌方面取得了很大的成就，其機制是非常復雜的，不能簡單的用現代醫學的某個觀點來概括說明[7]。中醫藥對腫瘤治療的主要理論基礎是扶正、固本、驅邪，目前的研究主要集中于單味藥的研究，多為體外試驗[8]。本研究采用了夏枯草、膽南星、玄參、龍血竭、冰糖草等8種中草藥，共有3個復方，各復方中草藥的配伍組成和含量不同，A復方由8種中草藥組成，B復方由其中4種中草藥配伍組成，C復方由其中2種中草藥配伍組成。夏枯草為唇形科夏枯草屬植物，主要含有三萜及其苷類 苯丙素類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、有機酸、揮發油及糖類等[9]，味辛、苦，性寒，有降糖、降壓、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤及活血化瘀等功效[10]。膽南星為制天南星的細粉與牛、羊或豬膽汁經加工而成，或為生天南星細粉與牛、羊或豬膽汁經發酵加工而成，在臨床上用于痰熱咳嗽，咳痰黃稠，中風痰迷，癲狂驚癇等癥[11]。玄參為玄參科植物玄參的干燥塊根，是常用的傳統中藥；其味甘、苦、咸、性微寒，具涼血滋陰、瀉火解毒的功效[12]，現臨床主要用于熱病煩渴、發斑、齒齦炎、扁桃體炎、急性淋巴結炎等[13]。龍血竭又名麒麟竭，為傳統名貴中藥，國產龍血竭的化學成分有黃酮、苷類、酚類、糖類等化合物[14]，龍血竭不溶于水，具有抗炎、止痛的作用，能抑制毛細血管的通透性，減少滲出，明顯抑制腫脹、縮短凝血時間，促進創面愈合，有效改善機體的免疫功能[15]。冰糖草為玄參科植物野甘草的全草，是壯族地區常用的一味壯藥，其味甜，性涼，具有清熱毒、除濕毒、通氣道和水道的功效[16]，主治感冒發熱，肺熱咳嗽，咽喉腫痛，腸炎，痢疾，腳氣水腫等[17]。我國現有中藥材資源12 807種，是世界上最大的藥材生產國。以傳統中草藥的理論和數千年臨床實踐為基礎，結合現代藥學理論和技術，嚴格進行藥學、藥效學與臨床研究，抗癌中草藥的開發和臨床應用將有新的更大進展[18]。本課題采用血清藥理學聯合MTT法，研究3種復方中藥對人大細胞肺癌細胞株NCI-H460細胞的體外抑制作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞株 健康成年的SD大鼠（200±20）g，SPF級，雌雄各半，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK桂2014-0002，實驗動物使用許可證號：SCXK桂2014-0004。人大細胞肺癌細胞NCI-H460購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗藥物 由夏枯草、膽南星、玄參、龍血竭、冰糖草等8種中草藥按不同比例組成，由北海博鏵醫院提供。注射用環磷酰胺，0.2 g/mL，百特醫療用品貿易有限公司，批號：5F063A。

1.3 實驗器材 超凈工作臺、CO2培養箱、倒置顯微鏡、臺式離心機、酶標儀、電子天平、恒溫水浴鍋、高壓滅菌器、-80 ℃低溫冰箱。

1.4 實驗方法

1.4.1 含藥血清制備實驗

1.4.1.1 3種復方中藥的制備 稱取夏枯草、膽南星、玄參、龍血竭、冰糖草等8種中草藥按不同比例用純凈水提取，A復方，由以上8種中草藥組成；B復方由以上中草藥中的4種組成；C復方由以上中草藥中的2種組成，濃縮藥液濃度至0.1 g/mL，置冰箱4 ℃保存備用。

1.4.1.2 注射用環磷酰胺的制備 環磷酰胺治療肝癌的成人日用量為4 mg/kg，每日或隔日1次。根據人和動物間每公斤體重折算系數表，換算出大鼠的劑量為成人用量的6倍左右（即25 mg/kg）。

1.4.1.3 含藥血清的制備 SPF健康成年的SD大鼠15只，隨機分為5組，即空白組、A復方組、B復方組、C復方組和環磷酰胺組，每組3只。給藥前禁食不禁水12 h，空白組灌胃等量的生理鹽水，A復方組、B復方組和C復方組分別以2000 mg/kg灌胃，環磷酰胺組以25 mg/kg腹腔注射。2次/d，

間隔12 h，連續給藥3 d。末次給藥后1 h腹主動脈取血，取血后室溫下靜置4 h，3000 r/min離心

15 min，分離血清，經56 ℃水浴滅活30 min后，0.22 ?m微孔濾膜過濾除菌，混合分裝于2 mL EP管中，置-20 ℃保存備用。

1.4.2 體外抑瘤實驗（MTT法）

1.4.2.1 細胞培養 從-80 ℃低溫冰箱中取出人大細胞肺癌NCI-H460細胞，迅速放于37 ℃水浴鍋中，并來回晃動使其在1 min內完全融化。在超凈臺中取出細胞轉移至15 mL離心管內，在1000 r/min離心5 min，棄去上層液體，將人大細胞肺癌NCI-H460細胞置于含有10%胎牛血清及雙抗的RPMI 1640培養液中培養，將培養瓶置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱內培養，待細胞養至覆蓋培養瓶瓶底80%～90%，用0.25%胰蛋白酶（1%胰酶∶0.2%EDTA=1∶3）進行消化，當細胞處于對數生長期后進行實驗。

1.4.2.2 MTT法檢測 用不含血清的培養基將含藥血清稀釋成5%、10%、20%、30%的濃度。取對數生長期的細胞株NCI-H460細胞，用胰酶消化后制成細胞懸液，調整細胞濃度至5×104個/mL，接種于96孔培養板，每孔0.1 mL細胞懸液，板周邊的孔不加細胞，留空白調零，即只加培養液不加細胞，將培養板置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱內培養24 h。貼壁后吸出原培養液，分別加入空白組、依癌膠囊組和環磷酰胺組各個濃度的含藥血清培養液，每組設5個復孔，繼續培養24、48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 ?L，37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱內培養4 h后，吸出原培養液，加入150 μL的二甲基亞砜（DM-SO），振蕩10 min，在酶標儀上于510 nm處測定每孔的吸光度（OD值），重復測3次。計算藥物對細胞的抑制率：抑制率（IR）=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在所選的濃度范圍內，3種復方中藥含藥血清對體外培養的NCI-H460細胞均有明顯的抑制作用，其中B復方組對NCI-H460細胞的抑制效果要較對A復方組和C復方組更顯著。24 h時，5%、10%、30%濃度的含藥血清對NCI-H460細胞抑制率：B復方組>環磷酰胺組>A復方組>C復方組；20%濃度的含藥血清對NCI-H460細胞抑制率：B復方組>環磷酰胺組>C復方組>A復方組。48 h，5%、10%、20%、30%濃度的含藥血清對NCI-H460細胞抑制率：B復方組>環磷酰胺組>A復方組>C復方組。A復方組、B復方組、C復方組各濃度的含藥血清與空白組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。3種復方中藥含藥血清對體外培養的NCI-H460細胞的抑制作用影響，見表1。

3 討論

肺癌是一種比較常見的惡性腫瘤，近年來，世界各國肺癌的發病率和死亡率均有明顯增高的趨勢[19]。中草藥治療惡性腫瘤以其毒副作用小的優點廣為大家接受，中藥及其復方制劑能夠通過多種不同途徑、多種方法應用于抗腫瘤臨床治療中，發揮獨特作用，盡可能避免正常細胞受到損傷，藥物毒副作用很小[20]。隨著中醫中藥在國際社會受重視的程度越來越高，中藥治療腫瘤將成為癌癥治療的一種重要途徑[21]。夏枯草、膽南星、玄參、龍血竭、冰糖草等8種中草藥均為我國傳統的中藥材，在殺滅腫瘤細胞和緩解癥狀體征方面有明顯效果。

本課題采用血清藥理學聯合MTT法，研究

3種復方中藥對人大細胞肺癌細胞株NCI-H460細胞的體外抑制作用。結果顯示，在所選的濃度范圍內，3種復方中藥含藥血清對體外培養的NCI-H460細胞均有明顯的抑制作用，差異均有統計學意義（P<0.01），其中B復方組對NCI-H460細胞的抑制效果要較對A復方組和C復方組更顯著。本課題組通過對3種復方中藥含藥血清的抑癌作用進行研究，為該藥進行下一步更深層次的優選配伍研究提供理論和實驗依據。

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（收稿日期：2017-01-10） （本文編輯：程旭然）