黃芪和三七成分結合對腦缺血/再灌注小鼠NF—κB信號通路及炎性因子的影響作用

王加良+丁祿榮+叢軍茲+尹昌浩

[摘要] 目的 研究黃芪和三七成分結合對腦缺血/再灌注小鼠Nα，NF-κB信號通路和炎性因子的影響作用。 方法 該次研究地點為牡丹江醫學院紅旗醫院藥劑科，2016年2—10月選取SP大鼠 45只分為假手術組、腦缺血再灌注組、黃芪多糖治療腦缺血再灌注組，每組15只，其中假手術組只進行大腦中動脈的剝離不進行栓塞。腦缺血再灌注組、黃芪多糖治療腦缺血再灌注組 進行 線栓法 阻塞 大腦中動脈2 h后 放開模擬腦缺血再灌注的條件。進行各時間點缺血再灌注后3、6、24、72 h的各個指標的變化。結果 腦缺血/再灌注后，腦組織TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達增加，分別為（3.58±0.19）、（1.06±0.18）、（2.39±0.27）。黃芪可以降低TNF-αmRNA的表達（2.58±0.16），三七可以同時降低TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達，分別為（0.65±0.11）、（1.79±0.23）。兩種藥物的配伍可以顯著抑制炎性細胞因子的表達效果。腦缺血/再灌注后，胞質NF-κB蛋白表達顯著減少，胞核NF-κB蛋白表達增加，NF-κB的核轉為率升高。 結論 黃芪和三七的主要成分配伍可以有效抑制缺血/再灌注后的腦組織NF-κB信號通路的激活，進而減少炎性細胞因子的生成，進而減輕腦缺血后腦組織繼發炎癥，更好的保護腦組織。

[關鍵詞] 黃芪；三七；腦缺血/再灌注；小鼠NF-κB信號通路；炎性因子

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）01（c）-0028-04

Effect of Astragalus Membranaceus and Sanqi Component on the NF-κB Signal Channel and Inflammatory Factor of Cerebral Ischemia-reperfusion Mice

WANG Jia-liang1， DING Lu-rong1， CONG Jun-zi1， YIN Chang-hao2

1.Department of Pharmacy， Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China；2.Department of neurology， Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China

[Abstract] Objective To research the effect of astragalus membranaceus and sanqi component on the NF-κB signal channel and inflammatory factor of cerebral ischemia-reperfusion mice. Methods 45 SP rats in department of pharmacy，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical Colkge from February to October 2016 were selected and divided into three groups with 15 cases in each， the Sham-operated group were given only brain arterial dissection but not embolism， and the cerebral ischemia-reperfusion group and the astragalin treatment for cerebral ischemia-reperfusion group released the condition of stimulating cerebral ischemia reperfusion after blocking the brain artery by the suture-occluded method， and the changes of various indexes at 3，6，24，72 h after the ischemia-reperfusion at each time point were observed. Results After the cerebral ischemia-reperfusion， the brain tissue TNF-α，IL-β and ICAM-1mRNA expression could increase， （3.58±0.19）， （1.06±0.18）， （2.39±0.27）， and Astragalus membranaceus could reduce the expression of TNF-αmRNA， （2.58±0.16） and Sanqi could reduce the expression of TNF-α，IL-β and ICAM-1mRNA （0.65±0.11） and （1.79±0.23）， and the combination of the two drugs could obviously inhibit the expression effect of inflammatory cytokines， after cerebral ischemia-reperfusion， the expression of kytoplasm NF-κB protein obviously decreased， and the expression of karyon NF-κB protein obviously increased and the examination and transmission rate of NF-κB increased. Conclusion The compatibility of astragalus membranaceus and sanqi can effectively inhibit the activation of brain tissue NF-κB signal channel after the cerebral ischemia-reperfusion thus reducing the production of inflammatory cytokines and relieving the brain tissue secondary inflammation after the cerebral ischemia and better protecting the brain tissues.

[Key words] Astragalus membranaceus； Sanqi； Cerebral ischemia-reperfusion； NF-κB signal channel of mice； Inflammatory factor

腦血管病在臨床上是常見及多發病，并且是當前3大致死疾病中的一種，該病有著較高的發病率、病死率、致殘率，缺血性腦血管病患者的人數在近幾年出現了上升[1-2]。缺血性腦血管病特別是腦缺血后再灌注損傷，有著極大的危害。腦缺血再灌注損傷指的是腦缺血造成的腦細胞損傷，將血液再灌注恢復之后，缺血性損傷會出現加重的情況[3-4]。此次研究時間為2016年2—10月，主要內容是研究黃芪和三七成分結合對腦缺血/再灌注小鼠Nα，NF-κB信號通路和炎性因子的影響作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

SPF級的雄性C57BL/6小鼠45只，體質量18～22 g，年齡6個月～1年，由湖南省維通利華實驗動物有限公司提供，合格證為：SCXK（湘）2009-0004。飼養在SPF級動物實驗室，濕度是45%，溫度是25℃。腦缺血再灌注的動物模型的制備：用頭端處理的尼龍釣絲，從頸外動脈向頸內動脈插入，可逆性阻斷大鼠一側大腦中動脈（MCA）。2 h后抽出釣線，制作成腦缺血再灌注的動物模型。將分為假手術組、腦缺血再灌注組、黃芪多糖治療腦缺血再灌注組，每組15只；兩組樣本的一般情況差異無統計學意義（P>0.05），可以進行比較。

1.2 方法

其中假手術組只進行大腦中動脈的剝離不進行栓塞。腦缺血再灌注組、黃芪多糖治療腦缺血再灌注組進行線栓法阻塞大腦中動脈2 h后放開模擬腦缺血再灌注的條件。進行各時間點缺血再灌注后各個指標的變化。①缺血再灌注后各個時間點的病理變化，組織化學染色證實腦缺血模型是否成功（包括小血管內皮的損傷，神經元的損傷）。②電鏡下利用伊文思蘭 （evansblue，EB）的滲透性評估血腦屏障的通透性，透射電鏡觀察血腦屏障超微結構的變化。③RT-PCR法檢測不同時間點 TLR4 、MyD88 mRNA水平的變化。④Westblot 法檢測不同時間點 TLR4 、MyD88 蛋白水平的變化。⑤ELISA法檢測IL-1、IL-6、TNF-a的量的變化。

1.3 統計方法

實驗數據通過SPSS 18.0統計學軟件分析處理，先將各組的數據通過方差齊性檢驗，多組間對比采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 腦缺血/再灌注后，腦組織TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達會增加

黃芪可以降低TNF-αmRNA的表達，三七可以同時降低TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達。兩種藥物的配伍可以顯著抑制炎性細胞因子的表達效果。腦缺血/再灌注后，胞質NF-κB蛋白表達顯著減少，胞核NF-κB蛋白表達增加，NF-κB的核轉為率升高。詳情見見表1。

2.2 各組腦組織的p-IkBα、胞核NF-kB蛋白表達、胞質和NF-kB核轉位率對比

和假手術組比較，腦缺血灌注組的p-IkBα蛋白表達顯著增加。黃芪多糖治療組降低p-IkBα蛋白表達的效果要強于各組。見圖1。

3 結論

缺血再灌注屬于缺血后的一種比較特殊的狀態，能夠對原來的缺血性損傷進行加重。它的產生機制當前并不十分清楚。Cao等[5]得知TLR4-/-小鼠在出現腦缺血再灌注后，腦損害程度要比野生鼠輕，血清TNF-α含量出現了顯著降低。針對體外培養BV-2細胞模擬腦缺血再灌注，同樣得到近似度較高的結果，運用逆轉錄多聚酶鏈反應（ RT-PCR）法對TLR4和核因子-κB（NF-κB） mRNA表達進行檢測后得知其出現了顯著增高，TNF-α水平同樣也出現了增高。以此可以可以推導得知TLR4參與了腦缺血再灌注后炎癥損傷的整個過程。Hua等利用鼠全腦缺血再灌注模型研究得知，野生鼠假手術組內，腦組織內不存在TLR4表達；而GCI/R后的72 h中，野生鼠海馬區及尾狀核保持在TLR4免疫活性；扣帶后回以及其它皮質區、丘腦前核、內囊、胼胝體等白質也有免疫活性，只是其活性很低；此外還得知，野生鼠NF-κB活性及磷酸化κB抑制因子都出現了升高，降低的是TLR4-/-的炎癥酶原水平。上述內容顯示，腦缺血再灌注后， TLR4信號通路得到激活，同時關系著抑制 （PI-3K） /Akt的信號通路，后者主要是抑制凋亡、促進增殖的關鍵信號通路[6]。

黃芪的作用是補氣固表。其中含有大量的多糖、蛋白質、黃酮類、甙類、生物堿、氨基酸、微量元素等活性物質 ，多糖免疫活性最佳[7-8]。自20世紀 80年代以來 ，關于對黃芪多糖 （APS）的研究報道中得知 ：自黃芪根內提取出的多糖APS是葡萄糖及阿拉伯糖多聚糖 ，毒性低 ，存在十分廣泛的的免疫增強及抗病毒功能，可以解除植物血凝素 （PHA）毒性用，能有效抑制抗免疫抑制藥物如強松龍 （PDS）、環磷酰胺 （Cy）等。黃芪多糖的免疫藥理學研究現狀主要涉及幾個方面：①調節肌體免疫功能：白介素-2（IL-2）可以提升巨噬細胞和自然殺傷細胞（NK）殺傷性；②直接調節對肌體存在重要免疫功能的T及B細胞分化增生。

腦缺血/再灌注后，腦組織TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達會增加，分別為（3.58±0.19）、（1.06±0.18）、（2.39±0.27）。黃芪可以降低TNF-αmRNA的表達（2.58±0.16），三七可以同時降低TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達，分別為（0.65±0.11）、（1.79±0.23）。兩種藥物的配伍可以顯著抑制炎性細胞因子的表達效果。腦缺血/再灌注后，胞質NF-κB蛋白表達顯著減少，胞核NF-κB蛋白表達增加，NF-κB的核轉為率升高。此次研究結果和鄧冰湘等人[9]的研究結果基本一致，具有研究意義。

綜上所述，該研究旨在通過研究黃芪多糖對腦缺血再灌注后TLR4/MyD88信號通路的影響的機制，為臨床應用提供理論依據。

[參考文獻]

[1] 黃小平，盧金冬，丁煌，等.黃芪和三七的主要有效成分配伍對腦缺血/再灌注小鼠NF-κB信號通路及炎性因子表達的影響[J].中國藥理學通報，2015（1）：141-146.

[2] 趙東輝.缺血性心腦血管病治療中抗栓藥物的新進展[J].中外醫療，2012，31（23）：181.

[3] 王樹林，安芳.中藥對腦缺血再灌注損傷保護作用及機制研究進展[J].神經藥理學報，2014（3）：39-48.

[4] 任翔，周文勝.丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注神經細胞凋亡的影響[J].中外醫療，2011，30（12）：18-19.

[5] 柏江鋒.中醫藥改善腦缺血再灌注損傷的實驗研究進展[J].河南中醫，2012（12）：1715-1720.

[6] 姜麗，寧可，包怡敏.三七總皂苷抗缺血再灌注損傷機制研究進展[J].中華中醫藥學刊，2016（2）：267-270.

[7] 邱詠園， 唐映紅， 王蓓，等. 黃芪和三七4種有效成分配伍對小鼠腦缺血再灌注早期抗氧化應激物質活性的影響[J]. 中華中醫藥雜志， 2014（6）：1940-1943.

[8] 黃小平， 歐陽國， 丁煌，等. 黃芪甲苷與三七有效成分配伍對小鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡和內質網應激的影響[J]. 中草藥， 2015， 46（15）：2257-2264.

[9] 鄧冰湘， 盧金冬. NF-κB信號通路在腦缺血再灌注損傷中的作用及中藥有效組（成）分的干預研究[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2014， 34（7）：54-58.