在宮頸癌篩查中液基細胞學制片方法及染色法探討

王瓏，吳霞，謝愛華，盧志勇，朱良，劉敏

(1、瑞金市婦幼保健院檢驗科，江西瑞金342500；2、浦東新區曹路鎮社區醫院，上海201209；3、瑞金市中醫院檢驗科，江西瑞金342500)

在宮頸癌篩查中液基細胞學制片方法及染色法探討

王瓏1，吳霞2，謝愛華3，盧志勇1，朱良1，劉敏1

(1、瑞金市婦幼保健院檢驗科，江西瑞金342500；2、浦東新區曹路鎮社區醫院，上海201209；3、瑞金市中醫院檢驗科，江西瑞金342500)

目的探討宮頸癌及癌前病變早期篩查工作中液基細胞學檢查技術（TCT）配合手工制片法靈活應用的實用檢測價值。方法根據液基細胞學檢查技術（TCT）制片原理，采取離心法制片配合手工法制片，用巴氏染色法染色。結果液基細胞學檢查能有效提高制片滿意率和診斷準確性，在宮頸癌篩查中具有實用推廣價值，TCT檢測其最終的目的是制作出可診斷的細胞數量多、無重疊的薄層細胞學均勻涂片，然后用巴氏染色，使用液基細胞學TBS診斷標準報告結果。我科采用離心制片法加上配合手工制片法制片，確保制片質量，從2008年9月至2016年9月20日，收集制作門診婦科及住院婦科液基細胞學標本22848例，經過離心制片法配合手工法制片，作出客觀準確報告。結論用離心制片法配合手工制片法制片，二種制片方法配合應用能夠取長補短,快速制片，經巴氏法染色，能確保標本制片質量高，從而提高病變陽性檢出率，為液基細胞學TBS診斷標準報告的準確性提供可靠保證，具有臨床實用推廣價值。

液基細胞學；離心；離心法制片；手工法制片；制片質量；巴氏染色

宮頸癌是我國女性很常見的婦科惡性腫瘤，也是導致婦女死亡率增加的重要疾病。隨著液基細胞學檢查技術（TCT）的廣泛應用，宮頸細胞學篩查成為我國婦科防癌篩查、監視早期發病和臨床診斷最為實用和最有效的方法。液基細胞學檢查技術（TCT）作為宮頸癌篩查的首選，其制片與染色方法特別重要，這是TCT能夠發出正確報告的保障。我科從2008年9月開始至今2016年9月20日，收集制作門診婦科，保健科，及住院婦科液基細胞學標本22848例，采用離心制片法配合手工制片法，對標本染片細胞作出客觀準確報告。現將制片方法和染色方法的一些經驗體會介紹如下。

1 資料與方法

1．1材料湖北泰康醫療設備有限公司提供以下所有設備和試劑：微電腦控制的TKY-B6B液基薄層細胞自動片機，液基細胞保存液，宮頸刷，一次性專用塑料吸管，載玻片制片夾，振蕩器，巴氏染色液。另外，鹽酸酒精，堿性溶液等自配，95%乙醇，中性樹膠，蓋玻片(22mm×22mm)，帶攝像的顯微鏡（OLYMPUS，CX31），高級鏡頭紙等醫院自備。

1．2方法

1．2．1標本采集門診婦科和保健科及住院部婦科醫生要嚴格按照操作程序認真進行標本的采集，標本采集時要盡量避免標本內含有過多的血液和黏液。標本采集完后直接將宮頸刷頭放人液基細胞保存液中，瓶內含有7ml左右細胞保存液，把瓶蓋擰緊，同時在標本瓶上貼好標注有患者：姓名、年齡，序號信息的標簽。

1．2．2液基薄層細胞學片的制備將保存液瓶分別用紅色記號筆編號分組，首先，把可用離心制片法制片的大部分標本分為第一組；其次，把含有較多血液、或者黏液的少部分標本，或者標本液很清亮內含細胞數少的標本，挑選出來組成按照手工法制片的第二組。然后，將已經編號的第一組液基細胞保存液瓶依次放入振蕩器內振蕩20min左右，每次12瓶；使其刷頭內的細胞充分脫落入保存液中。然后，打開瓶蓋，用鑷子夾住宮頸刷連接部分，輕輕在細胞保存液中涮洗幾次，以便刷頭部分的細胞全部進入保存液中，丟棄刷頭，加入2ml細胞處理液，充分混和均勻，把保存液瓶標本全部倒入10ml塑料刻度離心管內，擰緊蓋，再放入離心機中，以1200r/min的速度離心沉淀5min，取出，打開試管蓋，用一次性專用1ml塑料吸管插入保存液內，吸去上清液，剩余底部沉淀物1ml左右，充分混合均勻沉淀物，用吸管從底部吸取0.7ml左右混合均勻液體，滴人載玻片夾的小孔濾膜中，將載玻片夾放入細胞離心涂片機中，以1200r/min的速度離心制片5min，從制片機中取出已涂片的載玻片夾，從載玻片夾中取出已涂片的載玻片，自然晾干，然后盡快用95%乙醇固定15min，OG/EA染色(即巴氏染色)，常規用22mm×22mm蓋玻片與中性樹膠封片，高倍鏡鏡檢。

1．2.3手工操作法制片⑴把含有較多血液、或者黏液的少部分標本，或者標本液很清亮內含細胞數少的標本，挑選出來組成按照手工法制片的第二組，并且把保存液瓶編號，然后在該組細胞保存液瓶中加入lml冰醋酸（保存液與冰醋酸之比為9：1)振搖，再把第二組標本瓶依次放入振蕩器內振蕩25min，這樣可使大量的紅細胞充分溶解，黏液消化。⑵用1ml一次性塑料吸管，將振蕩好的保存液瓶中的液體和底部沉淀物打混勻，全部吸入一次性10ml塑料刻度離心管，用離心機1200r/min的速度離心5min。⑶將離心好的10ml塑料刻度離心管中的保存液，快速頃倒去上清液，留下管底0.5ml左右的底部沉淀物，再加入2ml細胞清洗處理液，充分混和均勻。再用離心機1200r/min的速度離心5min。然后將離心好的的10ml塑料刻度離心管中的保存液2ml左右，用1ml一次性塑料吸管吸去大部分，留下管底大概0.4ml左右的底物液即可。⑷用1ml塑料吸管，吸取管底部0.3ml左右混合均勻液體，在已經編號的干凈載玻片上，用懸滴法，滴下2~3滴液體，均勻涂片即成合格制片。⑸將已涂勻制片成功的載玻片，放入一個方型器皿中，讓載玻片一頭墊高2cm，使其多余液體向載玻片低的一方緩慢流去，放置0.5h左右膜片自然晾干后，立即放人95%乙醇液中固定5min。⑹染色，離心法制成的標本片先放置在標本架固定，等待手工操作法把標本制片好后，放入上述標本架固定好，將二組標本片按照順序放置并同時進行巴氏染色，鏡檢。⑺優點：手工操作法制片載玻片涂片面積大是常規TCT制片面積的3倍左右，顯微鏡下可以查看的細胞數多，可以提高陽性率。缺點：制片速度慢，整個過程耗時1.5h左右。

1．2.4巴氏染色步驟將二組標本片同時進行巴氏染色，首先，95%乙醇固定，10min。清水沖洗，2~3遍脫醇。建議：用一個可以裝下染色架的塑料杯，在自來水龍頭下，用緩慢的水流速度放水進入塑料杯，不要直接將染色架放在水龍頭下直接沖洗標本片，那樣容易把片中的細胞膜沖走部分。再進行下面染色步驟。蘇木素，5~10min。清水沖洗，2~ 3遍直至干凈。鹽酸分化液，1~2s，清水緩慢沖洗，2~3遍直至干凈。飽和碳酸鋰溶液，2min用于返藍，（飽和碳酸鋰溶液隨蘇木素染色液更換時同時更換）。清水緩慢沖洗，2~3遍直至干凈。95%乙醇固定，漂洗。橙黃-G62-3min，95%乙醇I、Ⅱ缸洗各1min。EA505min。95%酒精Ⅰ、Ⅱ缸洗各1min。無水酒精Ⅰ、Ⅱ缸洗各1min（脫水干凈）。二甲苯2缸各透明3min。

1．2.5液基細胞學的診斷使用帶攝像的顯微鏡（OLYMPUS，CX31）觀察標本染片，先用低倍鏡觀察細胞膜片尋找可以診斷的細胞，然后用高倍鏡做判斷；液基細胞學的診斷采用TBS(the Bethesda system，TBS)診斷標準報告檢測結果。

2 結果

TCT標本經離心涂片機制片，形成一直徑20mm的圓形細胞膜薄片，其細胞背景干凈、均勻平鋪、數量較多、重疊很少。另外有需要的標本經手工操作法制片，形成一個長45mm，寬22mm，細胞膜薄片，其細胞數量是TCT離心涂片機制片的3倍左右、均勻平鋪、有少部分細胞重疊現象。標本經離心涂片或經手工法制片，同時經巴氏染色后，色彩艷麗，對比鮮明，細胞核呈紫藍色、藍色，核仁紅色。底層、中層細胞胞漿藍色至淡紫藍色不等。表層細胞胞漿呈紅色、粉紅色。紅細胞呈紅色或橙紅色。黏液呈淡藍色。二種方法同時配合靈活使用，可以大大提高細胞陽性檢出率。為液基細胞學TBS診斷標準報告的準確性提供可靠保證。

3 討論

TCT制片技術和TBS報告系統能較全面反映宮頸病變的情況，現已被廣泛應用于婦科防癌普查，通過定期正規的篩查，能早期發現宮頸癌及癌前病變，從而達到早期治療的目的，對此，阻止病變升級是預防宮頸癌的關鍵。我科從2008年9月至2016年9月20日，收集制作門診婦科，保健科婦科，住院部婦科液基細胞學標本22848例，使用離心涂片機制作液基薄層細胞學涂片配合手工法制片，二種制片方法配合應用能夠起到取長補短，快速制片，為進行日常細胞學工作和進行大范圍的宮頸或者陰道細胞學篩查，彌補了單獨離心涂片機制片的不足，為臨床作出客觀準確的TCT結果報告。

液基薄層細胞學制片技術離心沉淀制片方法，一次可以處理12個標本，涂片質量可保證，可顯著降低技術人員的工作量、大大提高工作效率，但是，單獨使用離心沉淀法制片，在遇到血性標本，黏液過多標本，或者標本液很清亮內含細胞數少的標本時，如繼續使用離心沉淀法制片，制出的涂片上可以診斷的細胞數量很少，從而會增加假陰性率；所以，為了防止上述情況的發生，輔助采用手工操作法制片可彌補離心沉淀法制片之不足之處。但是，全部標本單獨采用手工操作法制片，在標本數量多的情況下，手工操作法制片，畢竟速度較慢，會影響標本檢測速度，導致標本出結果報告的時間延長，故二種制片方法靈活配合應用才能夠起到取長補短，快速制片，盡快出結果報告的目的。注意以下幾個重點：

⑴獲得高質量的標本是提高液基細胞學涂片檢測陽性率的保證：臨床送檢的標本應將刷頭在保存液中充分涮洗，以便獲得較多可診斷的細胞數量，一般要求每張液基細胞涂片要有大約5000個保存完好、結構形態清晰的鱗狀上皮細胞[1，2]。⑵標本要及時固定：固定的目的在于盡可能的保持細胞原有形態結構，凝固、沉淀細胞內原有產物[3]，盡管液基細胞保存液中含有一定量的固定液．但遠未達到固定良好的效果．因此臨床在采集完標本后應立即將宮頸刷頭放入液基細胞保存液中，擰緊瓶蓋后盡快送檢；細胞病理科收到標本后，應盡快制作薄層細胞學涂片，自然晾干后，立即放人95%乙醇液中固定20min。⑶處理前應先檢查送檢標本質量的好壞：造成液基細胞學標本不滿意的常見原因為過多的血液和(或)黏液，白帶過多等因素[4-6]細胞保存液中含有紅細胞和黏液溶解劑，一般不用特殊處理，若送檢標本含血液過多，可在細胞保存液中加入lml冰醋酸（保存液與冰醋酸之比為9：1)振搖，離心沉淀即可[7，8]標本含黏液過多，可采用酶消化處理，離心后涂片[9]。⑷操作制片離心機時：標本細胞保存液瓶每個瓶蓋要重新擰緊，防止液體溢出瓶蓋外面，放置在振蕩器孔槽內，振蕩20min.載玻片與制片夾之間墊塞要塞緊，制片夾標本放置在懸掛離心機盤卡槽后，檢查是否對稱放置牢靠，嚴防沒有對稱放置制片夾標本就開機離心制片，不然就此開機，就會產生離心制片機內制片夾標本被毀的嚴重后果。⑸離心沉淀后移入量的把握是關鍵：若沉淀物較多，可傾其上清夜，剩下少量細胞保存液與沉淀物混均．勿太黏稠．用一次性專用塑料吸管(吸管上有刻度1ml，吸取0．7ml左右即可。若沉淀物不多，可直接將吸管插入細胞保存液瓶底部吸取0．7ml左右然后滴加入載玻片上的微孔濾膜中，混均，充滿整個濾膜，勿出現空白區，否則離心涂片不均。經多次實驗證明，我們認為吸取0．7ml左右為最佳，過少容易產生涂片不均，或者有時出現空白區不見細胞。過多易出現殘存液體，不容易干，細胞漂浮，晾干后細胞膜厚薄不均，細胞重疊，不便鏡檢等客觀現象。⑹染色時間把握要恰當：液基細胞學涂片的常規染色方法是蘇木素，巴氏染色法(OG/EA染色法)[10]根據染液配制的時間長短，適當增加或減少染色的時間，使用過久的染液要及時更換，重新配制，或者購買新染色液更換，染色要豐富而鮮艷，細胞核染色要深淺適度，結構要清晰，不同層次的上皮細胞胞漿應著不同顏色（藍色、紫藍、粉紅色、紅色)[1]。細胞核染色效果的估算可參照下面方法：新染色液，每次按染1000人份左右計算，用30人份的銅制染色架，總的可染33個架次；在使用新蘇木素染色液時，可以按照以下簡單方法估算：第1～11架次，用5～6min；第12～22架次，用7～8min；第23～33架次，用9～10min。染色架次到33架左右，細胞核著色效果不佳，胞漿不太清晰時，要保持細胞核染色要深淺適度，結構要清晰，就必須適時更換染色液（巴氏染色法染色液更換時間，以蘇木素染色液的細胞核染色效果為準，需要更換時全套染色液同時更換）。還有：氣溫較低時蘇木素染色液不易著色，可適當延長染色時間；故冬天與夏天比較，夏天溫度高＞35℃時，染色時間在原來染色時間的基礎上減低1～3min。冬天溫度低＜15℃時，染色時間在原來染色時間的基礎上增加1～3min。蘇木素貯存溫度過高會導致氧化過度，應注意避光貯存于5℃～25℃環境。⑺鹽酸分化時間，很關鍵；可以按照下面方法操作：以一份新鹽酸酒精能分化1000人份計算，每架30人份，大概能夠分化33架次，在新換液時：第1～7架次用：1s；第8～13架次用：1.5s，第14～20架次用，2s，第21～27架次，2.5s，第28～33架次用，3s左右。原因：分色是用鹽酸洗去細胞吸附過多的蘇木素，讓核質對比鮮明，分色時間不宜過長，否則核變淡染。另外，鹽酸分化液隨著使用次數的增加，鹽酸乙醇的濃度會逐漸減低，所以只有逐漸增加鹽酸分化時間，來彌補鹽酸乙醇溶液因為濃度的降低使其影響細胞酸化效果。⑻稀釋后的碳酸鋰溶液用于藍化，時間不宜超過3min，不然，細胞膜片會產生背景灰暗，細胞胞漿染色偏暗，整體染色不鮮艷等等缺陷。藍化數量也應該以藍化1000人份為標準計算，使用達標準的碳酸鋰溶液應該及時更換，以免影響藍化效果。⑼染色試劑貯存時，應盡量避免高溫、低溫及光亮環境，以免影響品質和染色效果。染色試劑應該有計劃購買，特別是南方夏天室外溫度很高，應該防止運輸途中高溫引起試劑質量變化，不宜一次性購買過多。⑽顯微鏡的保養：特別重要的是高倍鏡（40×），要經常用高級鏡頭紙粘上鏡液維護，

TCT是臨床上宮頸癌早期篩查的常用方法之一，是現存的最先進的宮頸癌細胞學檢查技術，與傳統巴氏染色相比，TCT可明顯提高樣本細胞的質量和宮頸癌細胞的檢出率，并能發現部分人處于癌前病變狀態的細胞，并且TCT可以減少巴氏染色的重復次數，更容易被患者接受。離心制片法的大部分標本，TCT檢查結果陽性率為41.5%[11]。引起陽性率不高的一個重要原因是：當部分標本含有較多血液、或者黏液時，或者標本液很清亮內含細胞數少的標本時，容易造成檢測假陰性，對此，我們通過把上述含有較多血液、或者黏液少的部分標本，或者標本液很清亮內含細胞數少的標本，挑選出來組成按照手工法制片的第二組制片方法，可以大大提高TCT檢查結果陽性率；作為宮頸癌篩查的首選方法，其制片與染色方法特別重要，這是TCT能夠發出正確報告的保障。

現在很多醫院細胞病理科都是單獨使用一種方法在做液基細胞制片，我們認為很不妥當，因為單獨使用離心法做TCT液基細胞制片，容易產生假陰性，而單獨使用手工法做細胞制片，在工作量大的情況下，又會影響工作效率，綜上所述，我們認為二種方法各有優缺點，只有同時把上述二種方法相互靈活配合使用，取長補短，快速制片，才能夠確保細胞病理標本制片做到高標準高質量出報告結果，從而提高標本病變陽性檢出率。

總之，認真掌握好液基細胞學檢查技術（TCT），用離心制片法配合手工制片法制片，二種制片方法配合應用，經巴氏法染色，能夠確保標本制片高質量，為液基細胞學TBS診斷標準報告的準確性提供可靠保證，并可大大提高病變陽性檢出率，提高臨床診斷準確性，起到早發現早診斷早治療的作用，有助于降低宮頸癌的發病率，具有臨床實際應用推廣價值。

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R737.33，R446.8

A

1674-1129(2017)04-0532-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.027

2016-11-22；

2017-05-05)